很多童鞋在做WB的時(shí)候，都會(huì)碰到一些奇奇怪怪的事情,，有些事情可以解釋,，而有些事情，簡(jiǎn)直是詭異到摸不著頭腦,。下面小編給大家整理一些WB中的常見問題,，大家一起探討探討吧。

1,、細(xì)胞裂解液主要組分有哪些,？SDS、NP-40,、TritonX-100有何作用,？

答：細(xì)胞裂解液一般含有緩沖成分Tris，裂解成分（SDS,、NP-40,、TritonX-100等），以及蛋白酶抑制劑成分（PMSF等）,。

SDS,、NP-40、TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的,，或者說作用力量強(qiáng)弱不同,。

SDS屬于離子型去垢劑，最厲害,，基本可以把細(xì)胞完全破掉,，DNA會(huì)釋放出來，裂解液變得很粘稠,。

NP-40是很溫和的去垢劑,，1%濃度的基本可以破壞掉包膜，而對(duì)核膜破壞的作用弱,，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白,。

TritonX-100的能力介于NP-40和SDS之間，偏向于NP40,，也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一,，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì)使蛋白變性失活）。

2,、Western 及 IP細(xì)胞裂解液,、RIPA裂解液、NP-40裂解液,、SDS裂解液的用途,？

答：用于普通的Western 、IP或co-IP,，我們推薦使用Western及IP細(xì)胞裂解液,，該裂解液已被國(guó)內(nèi)各大研究機(jī)構(gòu)廣泛使用，用戶普遍反映很好,。裂解細(xì)胞或組織后,，沒有非常粘滯的透明狀DNA團(tuán)塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作,。另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化,，蛋白的Western 檢測(cè)。對(duì)于某些特殊蛋白的IP,，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想,，可以嘗試用RIPA裂解液（強(qiáng)、中或弱）或NP-40裂解液,。如果發(fā)現(xiàn)IP的時(shí)候背景很高,，即非特異的蛋白也被IP下來,，則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液（強(qiáng)或中）,。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來,，則說明裂解液的強(qiáng)度過強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液如RIPA裂解液（弱）或NP-40裂解液,。對(duì)于某些難溶解蛋白的Western,，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液,，例如RIPA裂解液（強(qiáng),、中）或SDS裂解液。

3,、聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理,？

答：聚丙烯酰氨凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用的電泳技術(shù),。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法,?；瘜W(xué)聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑,。在聚合過程中,，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合,，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián),，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng),，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類,，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液PH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下,，主要靠電荷和分子篩效應(yīng),。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，PH,，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性,，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有點(diǎn)和效應(yīng)，分子篩效應(yīng),，還具有濃縮效應(yīng),，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成,。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠,，凝膠緩沖液為PH6.7的Tris-HCl，分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠,，凝膠緩沖液為PH8.9 Tris-HCl,。電極緩沖液是PH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠,、2種緩沖體系,、3種PH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑,、PH值,、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素,。

4,、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直,，上樣的量和灌膠是否很重要,，電壓有什么要求？

答：影響跑膠跑的質(zhì)量,，有以下幾個(gè)因素：

1）  電壓,，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小,，條帶越漂亮,，濃縮膠55V，分離膠75V就能跑得很好,。

2）  膠的均勻度,，膠越均勻，條帶越窄,，分離越均勻,。倒膠之前，一定要充分混勻,，玻璃板一定要干凈,，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去,，避免稀釋上層的分離膠,。

5、western blot使用的膜哪種最好啊,，PVDF好還是NC膜,，如何選擇？

答：PVDF膜可重復(fù)使用,，特別適合蛋白印跡,，結(jié)合能力較強(qiáng),，但價(jià)格比較昂貴。NC膜價(jià)格比較便宜,，應(yīng)用較廣,，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF,，不能重復(fù)使用,，但蛋白吸附容量高，親水性較好,。都可以用麗春紅染色,。

6、請(qǐng)問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么,？

答：一般而言,，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話,，反復(fù)洗幾次后,，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差,。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱,。這樣的話,，PVDF膜和蛋白接合較牢固，不易脫落,，結(jié)果較好,。

7、加甲醇的目的是什么,？

答：加甲醇起著一定的固定作用,，因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去。（特別是在硝酸纖維素膜上,，因?yàn)镹C膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱）,。

8、我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好,，不管是什么大小的蛋白）不知道有哪些辦法,？

答：不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過小、時(shí)間過短）或過度轉(zhuǎn)移（電壓過大,、時(shí)間過長(zhǎng)）的問題,，魚（小分子量）和熊掌（大分子量蛋白）不可兼得。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界,，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,，下半時(shí)間短，上半時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),，應(yīng)該會(huì)好一些,。

9、Western blot中濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)的方法區(qū)別,？

答：半干式轉(zhuǎn)膜速度快,，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。

10,、半干轉(zhuǎn)是否要求膜,，濾紙，膠同樣大??？因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則,，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn),，那樣會(huì)不會(huì)短路？什么是短路,？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢,？

答：可以相等，但是如果膜比凝膠大就比較容易形成短路了,，上下兩層濾紙也不能因過大而相互接觸,，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過膠和濾紙,。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行,，正常的半干是慢慢變高的，最后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的,。一般buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路,。

11、麗春紅（Ponceau S）染色的原理及特點(diǎn),？

答：麗春紅染色（Ponceau S Staining Solution）可以用于PVDF膜,、硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜上的蛋白的檢測(cè)。麗春紅帶負(fù)電荷,，可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合,，同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)結(jié)合，從而形成紅色的條帶,。麗春紅對(duì)蛋白的染色是可逆的,，染色后可以用蒸餾水，PBS或其它適當(dāng)溶液洗去。

12,、如何更高效的監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜效率呢,？

答：立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無顏色,，也無法提示W(wǎng)B結(jié)果會(huì)不會(huì)失?。既灸z無顏色也不能說明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染）,，你仍然得繼續(xù)后面的操作,；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了,，也許只是另外一個(gè)分子量大小相近的蛋白,。因此，無論立春紅染膜失敗或成功,，你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作,。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時(shí)間，而且增加一輪漂洗的操作,，對(duì)膜和膜上的蛋白都不好,。

除了立春紅染色外，你還可以選擇預(yù)染Marker來監(jiān)測(cè)你的轉(zhuǎn)膜效率,。理論上,，同時(shí)轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的,，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上,，非常直觀、不會(huì)增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）,。

13,、抗體孵育緩沖液的選擇？

答：某些實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體,，而有些實(shí)驗(yàn)室用不含封閉劑的TBST來孵育抗體,，結(jié)果因抗體而異，有時(shí)兩者結(jié)果相同,，有時(shí)結(jié)果不同,。如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 – 0.25%)脫脂奶粉或 BSA的封閉液來稀釋,，可產(chǎn)生相對(duì)更強(qiáng)的信號(hào)條帶,。