高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展,，測序通量大幅增加,，要求上游樣本處理盡可能簡單快速，以提高NGS整個(gè)流程的工作效率。文庫構(gòu)建,，尤其是DNA文庫構(gòu)建是二代測序建庫技術(shù)的基礎(chǔ),，其他的建庫方法都以該方法為基礎(chǔ)發(fā)展而來。DNA建庫方法是分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)原理,，其本質(zhì)就是在待測片段兩端加上接頭的過程,，目前DNA建庫方法按照接頭連接方式不同可分為五類：

TA克隆連接接頭建庫是目前應(yīng)用最廣泛的建庫技術(shù)，簡單描述就是：將提取好的DNA片段化,，在進(jìn)行末端修復(fù)和加A尾,，然后連接上接頭（adapter），最后通過PCR擴(kuò)增（可選）,，中間再穿插著純化/分選步驟就完成了文庫的構(gòu)建,。在這里，提前合成好的帶T尾接頭和末端帶A的目的片段在DNA連接酶的作用下通過TA克隆方式連接（圖1）,。

圖1. TA克隆連接接頭建庫法流程圖

TA克隆連接接頭可以有效保留樣本幾乎所有基因組信息,，非常有利于未知拷貝數(shù)的和基因組變異的檢測，是全基因組測序和外顯子測序的主要建庫手段,，目前市面上有很多試劑盒供應(yīng),，直接應(yīng)用試劑盒建庫，操作簡單,，2.5-3.5h就可獲得穩(wěn)定高品質(zhì)文庫,。

Swift建庫方案是Swift BioSciences公司獨(dú)有的NGS建庫技術(shù)，基本步驟與TA克隆連接接頭建庫方法類似,，是由TA克隆連接接頭的方法發(fā)展而來,。主要通過兩步法在插入片段兩端引入P5和P7接頭序列，末端修復(fù)之后,，先在3^,，端連接帶P7的接頭，再在5^,，端連接帶P5的接頭,，最后通過PCR擴(kuò)增（可選）完成文庫構(gòu)建（見圖3）。Swift法建庫主要宣傳優(yōu)勢是文庫轉(zhuǎn)化效率高,，特別是針對cfDNA樣本的建庫實(shí)驗(yàn),。但此方法操作比較繁瑣，新手很難達(dá)到其官方宣傳的建庫效率,。

圖2. Swift法建庫流程圖

轉(zhuǎn)座酶法建庫技術(shù)的核心是Tn5轉(zhuǎn)座子,，Tn5轉(zhuǎn)座子是一段含有若干抗性基因和編輯轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段，是一種細(xì)菌轉(zhuǎn)座子,，最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn),。NGS文庫構(gòu)建即把DNA樣本片段化或篩分成指定長度的目標(biāo)序列,，再加上寡核苷酸接頭P5、P7（和條形碼Barcode）,，用于后續(xù)測序上機(jī),。傳統(tǒng)建庫方式需經(jīng)過DNA片段化、末端修復(fù),、接頭連接,、文庫擴(kuò)增、多次純化分選等步驟,，耗時(shí)較長,，將Tn5用于測序文庫構(gòu)建時(shí)，可將DNA片段化,、末端修復(fù),、接頭連接等多步反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?步反應(yīng)，極大縮短建庫時(shí)間,，提高工作效率,。

Tn5用于NGS建庫的體外轉(zhuǎn)座要素包含：轉(zhuǎn)座子的末端序列、靶DNA,、轉(zhuǎn)座酶（Tnp）和Mg²⁺（激活劑），轉(zhuǎn)座法建庫形成的文庫結(jié)構(gòu)如下：

圖3. 轉(zhuǎn)座法建庫文庫結(jié)構(gòu)

將P5,、P7端部分接頭序列（Adapter 1/2）+轉(zhuǎn)座子末端序列設(shè)計(jì)合成供體DNA,，Tnp識別轉(zhuǎn)座子末端形成帶有P5、P7端部分接頭的Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體（見下圖4）,。該復(fù)合體識別受體DNA的靶序列（Target site）,，切斷受體DNA，并插入攜帶的供體DNA,，形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1,，一端帶有P7部分接頭Adapter 2的DNA，之后通過PCR加上Barcode以及接頭其余部分,，形成含P5端與P7端完整接頭的DNA文庫,。

圖4. Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)用于文庫構(gòu)建

轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有快速“剪切、粘貼”,、“復(fù)制,、粘貼”的功能，已被創(chuàng)新應(yīng)用于NGS領(lǐng)域,，如ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing,，利用高通量測序檢測轉(zhuǎn)座酶易接近的染色質(zhì)），LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion,，通過轉(zhuǎn)座子的線性放大）,，單倍體分型,，結(jié)構(gòu)變異檢測等，不僅高效簡便,，有效縮短N(yùn)GS樣本建庫時(shí)間,，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化快速測序,，提高測序分辨率,，同時(shí)能夠被靈活改造，應(yīng)用于更多的技術(shù)創(chuàng)新,。

擴(kuò)增子建庫是指利用PCR反應(yīng)在待測DNA片段兩端加上接頭的方法,，原理相對比較簡單，只需要兩輪PCR和兩步純化就可以得到目標(biāo)區(qū)域的文庫（如圖5）,，其中第一步是含通用序列的引物與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合,，第二步通過PCR反應(yīng)連接測序接頭，使得構(gòu)建的文庫可以用于上機(jī)測序（圖6）,。

圖5.擴(kuò)增子建庫的操作步驟

圖 6.擴(kuò)增子建庫的兩次PCR反應(yīng)

與其它建庫方法對比,，擴(kuò)增子建庫通過定制引物Panel完成文庫構(gòu)建。在臨床背景下,，擴(kuò)增子建庫方法可以針對疾病目標(biāo)基因進(jìn)行捕獲,，提高目標(biāo)基因檢測的覆蓋度和測序深度，解釋臨床結(jié)果,。相對于其他建庫方法來說,，擴(kuò)增子方法建庫可以通過單次測序反應(yīng)檢測更多患者樣本，后期生信分析的任務(wù)大大減少,，得到的數(shù)據(jù)更易于儲存和管理,。

但是此方法的應(yīng)用還受到一些限制：

1）PCR擴(kuò)增子建庫應(yīng)用于全外顯子或全基因組建庫時(shí)，由于設(shè)計(jì)出的引物不能完全擴(kuò)增出所有的待測片段會導(dǎo)致最終的文庫覆蓋率較低,。

2）當(dāng)擴(kuò)增子之間有重疊時(shí),，為了避免重疊部分產(chǎn)生的短擴(kuò)增子的優(yōu)勢擴(kuò)增的影響，需要有兩個(gè)或多個(gè)引物池,，這樣就會導(dǎo)致試驗(yàn)流程復(fù)雜且增加成本,。

3）多重PCR反應(yīng)中容易出現(xiàn)引物二聚體的積累，引物二聚體由彼此雜交的引物分子組成,，多重PCR反應(yīng)中多對引物的存在大大提高了引物二聚體的形成機(jī)會,，而引物二聚體的擴(kuò)增會大量消耗引物本身和體系中其他的原料，甚至有抑制所需DNA序列擴(kuò)增的效果,。

平末端連接接頭的方法基于Ion Torrent平臺,。與Illumina平臺類似，Ion Torrent平臺的文庫構(gòu)建目的也是在片段化好的DNA片段兩端加上特定接頭,，該方法一般包括4個(gè)步驟：DNA樣本片段化,、末端修復(fù),，連接adapter（PI和A/P1和X），選擇性回收DNA片段,，文庫PCR富集,，純化PCR產(chǎn)物（見圖7）。

       圖7.平末端接頭連接建庫方法流程圖（Ion Torrent平臺）

在這里需要注意的是：在Ion Torrent平臺構(gòu)建好的文庫通過油包水PCR種到測序柱子上,，文庫中的X或A接頭是測序起始端,，而P1接頭是是連到測序珠子的這一端。與Illumina通過采集熒光信號記錄記錄堿基序列的方法不同,，Ion Torrent的測序是通過微環(huán)境中pH值短暫的下降被pH電極檢測到并且把測得的值傳給計(jì)算機(jī)記錄,。

綜上，NGS建庫可以按照接頭加入目的片段的不同分為5種,，其中TA克隆連接接頭建庫法應(yīng)用最廣泛,，適用于絕大多數(shù)樣本建庫，是目前商業(yè)化建庫方式的主流,；Swift法與TA克隆連接接頭法類似,，操作上相對繁瑣，P5接頭和P7接頭是分兩步連接上的,；轉(zhuǎn)座酶法只需1h 40min即可完成文庫構(gòu)建,，可以節(jié)省大量的人力，但是在應(yīng)用上只適用于cDNA和全基因組等文庫的構(gòu)建,，且轉(zhuǎn)座酶本身具有偏好性,，對后續(xù)的測序質(zhì)量會有一定的影響；PCR擴(kuò)增子建庫是捕獲建庫的一種,，適用于臨床背景下靶向基因的研究，平末端連接接頭建庫適用于Ion Torrent平臺,，Ion Torrent市場占有率相對較低,，所以此建庫方法應(yīng)用范圍相對較少（見下表）。

表 NGS 5種建庫方法比較