PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下,，以母鏈DNA為模板,，以特定引物為延伸起點(diǎn)，體系中加入dNTP,、Mg2+以及延伸因子,、擴(kuò)增增強(qiáng)因子，通過(guò)變性,、退火,、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程,，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA,。

圖1. PCR擴(kuò)增流程

常規(guī)PCR的擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)間并不是放進(jìn)PCR儀，運(yùn)轉(zhuǎn)程序才開(kāi)始擴(kuò)增,。當(dāng)體系配置完成的時(shí)候,，擴(kuò)增就開(kāi)始了,，這可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，熱啟動(dòng)PCR可以解決這一問(wèn)題,。什么是熱啟動(dòng)PCR,？當(dāng)反應(yīng)體系配制好后，在反應(yīng)初始加熱階段或“熱啟動(dòng)”階段,，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放,，使得DNA聚合酶被激活。具體激活時(shí)間和溫度取決于DNA聚合酶以及熱啟動(dòng)修飾物的性質(zhì),。該方法主要利用抗體,、親合配體、或化學(xué)修飾物等修飾物,，來(lái)抑制的DNA聚合酶的活性,。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制,，熱啟動(dòng)技術(shù)為在常溫下配制多個(gè)PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利,，且無(wú)需犧牲PCR反應(yīng)的特異性。

圖2. 基于抗體熱啟動(dòng)技術(shù)的DNA聚合酶

逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR,，RT-PCR),，是從mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)流程是先提取組織或細(xì)胞中的總RNA,，以O(shè)ligo（dT）為引物,，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá),。

注：oligo(dT)是由數(shù)量少于20的脫氧胸苷酸連接而成的核苷酸鏈，它可以特異性地結(jié)合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾),，從而使逆轉(zhuǎn)錄酶只能逆轉(zhuǎn)錄含有poly(A)尾的mRNA,。

圖3. 逆轉(zhuǎn)錄PCR原理

熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板進(jìn)行定量分析的方法。常用的qPCR方法有熒光染料法（SYBR Green I）和探針?lè)ǎ═aqMan）,。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反應(yīng)體系中,，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號(hào),，沒(méi)有摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步,。探針?lè)ǎǔＳ肨aqMan探針）：探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

圖4. 染料法原理

圖5. 探針?lè)ㄔ?/span>

巢式PCR（Nested PCR）是指利用兩套PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增,，第二輪的擴(kuò)增產(chǎn)物才是目的基因片段,。如果第一對(duì)引物（外引物）的錯(cuò)配導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物被擴(kuò)增，相同的非特異性區(qū)域被第二對(duì)引物識(shí)別并繼續(xù)擴(kuò)增的可能性非常小,，所以通過(guò)第二對(duì)引物的擴(kuò)增,，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于：有助于從有限的起始DNA中擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物,。巢式PCR的實(shí)驗(yàn)原理為根據(jù)DNA模板序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,，利用第一對(duì)引物（稱為外引物）對(duì)靶DNA進(jìn)行15-30個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增；第一輪擴(kuò)增結(jié)束后將一小部分起始擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100-1000倍加入到第二輪擴(kuò)增體系中作為模板,，利用第二對(duì)引物（稱為內(nèi)引物或巢式引物,，結(jié)合在第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，進(jìn)行15-30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增,，第二輪PCR的擴(kuò)增片段短于第一輪,。

圖6. 巢式PCR原理

降落PCR（Touchdown PCR）是一種通過(guò)調(diào)整PCR循環(huán)參數(shù)，提升PCR反應(yīng)特異性的方法,。在降落PCR中,，前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度設(shè)定為，比引物的最高退火溫度（Tm）再高幾度,。較高的退火溫度能有效減少非特異性擴(kuò)增,，但同時(shí)較高的退火溫度會(huì)加劇引物與目標(biāo)序列的分離，導(dǎo)致PCR的產(chǎn)量降低,。因此在開(kāi)始的幾個(gè)循環(huán)中,，退火溫度通常設(shè)置為每個(gè)循環(huán)降低1℃，以增加體系中目的基因的含量,。當(dāng)退火溫度降低到最佳溫度時(shí),，剩余循環(huán)都維持此退火溫度。通過(guò)這種方法,，在PCR過(guò)程中,，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會(huì)出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物。

圖7. 降落PCR

注：通過(guò)以較高的溫度起始,，再隨著循環(huán)逐漸降低到最佳退火溫度（黑色曲線）,，這種PCR方法可提升反應(yīng)特異性（黃色曲線）。目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量（綠色曲線）相應(yīng)的得到富集,。

直接PCR是指直接從樣品擴(kuò)增目標(biāo)DNA,，無(wú)需進(jìn)行核酸分離純化。直接PCR分兩類,，直接法：取少量樣本直接加入到PCR Master Mix中,，進(jìn)行PCR鑒定；裂解法：樣本取樣后,，加入裂解液中,，裂解釋放基因組，取少量裂解上清液加入到PCR Master Mix中,，進(jìn)行PCR鑒定,。這種方法簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了動(dòng)手操作時(shí)間,，同時(shí)可避免純化步驟DNA的損失,。

推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴(kuò)增。細(xì)胞碎片,、蛋白,、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會(huì)抑制PCR反應(yīng),。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能,。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度,，因此可從未純化樣本中擴(kuò)增微量的DNA。

圖8. 直接PCR示意圖

重疊延伸PCR技術(shù) (gene splicing by overlap extension PCR,，SOE PCR),，是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使 PCR 產(chǎn)物形成了重疊鏈,，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)目前主要有兩個(gè)應(yīng)用方向：構(gòu)建融合基因,；基因定點(diǎn)突變,。 

圖9.重疊延伸PCR技術(shù)用于構(gòu)建融合基因的原理

反向PCR （Inverse PCR, IPCR）是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的末知序列進(jìn)行擴(kuò)增,。反向PCR設(shè)計(jì)之初是為了用于確定鄰近未知區(qū)域的序列,，多用于研究基因的啟動(dòng)子序列；致癌性染色體重排，如基因融合,、易位和轉(zhuǎn)座,；以及病毒基因整合，現(xiàn)在也常用于定點(diǎn)突變,，復(fù)制一個(gè)具有預(yù)期突變的質(zhì)粒,。反向PCR流程，首先對(duì)模板進(jìn)行限制性酶切消化和連接,，選定的限制性內(nèi)切酶不可剪切已知序列,，從而使連接發(fā)生于側(cè)翼未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA片段優(yōu)化連接步驟,，使其傾向于自我連接而非多片段連接（即形成連環(huán)體）,。完成自我連接后，從DNA的已知區(qū)域啟動(dòng)反向PCR,。所獲得的擴(kuò)增子每個(gè)末端都含有部分已知DNA序列,。隨后，對(duì)這些擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序,，檢測(cè)上述已知序列的相鄰區(qū)域,。

圖11. 使用反向PCR來(lái)擴(kuò)增和鑒定臨近未知區(qū)域序列

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù),。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法,，光度法基于核酸分子的吸光度來(lái)定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值,，Ct值就是指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù),；數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量,，是一種絕對(duì)定量的方法,。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中,，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè),。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào),，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào),。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度,。除了基因表達(dá)和拷貝數(shù)檢測(cè),，數(shù)字PCR也適用于諸如低頻等位基因的辨別、病毒滴定和二代測(cè)序文庫(kù)的絕對(duì)定量,。

圖12. 數(shù)字PCR流程