之前的幾期課堂講座給大家分享了ELISA實(shí)驗(yàn)的原理,，操作步驟以及實(shí)驗(yàn)中的常見問題（感興趣的小伙伴可以去視頻專區(qū)收看），近期又收到部分小伙伴的反饋問題,，主要集中在數(shù)據(jù)處理上,。小編看了也覺得比較可惜，整個ELISA實(shí)驗(yàn)做得不錯,，可惜在最后的數(shù)據(jù)處理上犯了錯誤,，直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出了大問題，可謂功虧一簣,。接下跟著小編進(jìn)行一次實(shí)戰(zhàn)案例的分析,，詳細(xì)了解一下愛必信ELISA試劑盒的數(shù)據(jù)處理過程吧~

話不多說，先上圖：

圖一. 客戶提供原始OD值圖（涉及未發(fā)表數(shù)據(jù),，部分隱去,，部分略作處理）

圖二. 客戶處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

客戶反饋，部分?jǐn)?shù)據(jù)OD出現(xiàn)負(fù)值,，無法處理,，覺得試劑盒有問題。小編接到這個case之后,，簡單的看了一下客戶的數(shù)據(jù),，就發(fā)現(xiàn)幾個明顯的數(shù)據(jù)處理問題，而根據(jù)客戶的原始OD數(shù)據(jù),，初步判斷,，試劑盒是正常的，并且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還比較可靠,。不知道是否有聰明的小伙伴已經(jīng)從這個數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了問題呢,？沒關(guān)系，跟著小編一起來抽絲剝繭的詳細(xì)分析一下吧~

1. OD值出現(xiàn)負(fù)值

大量樣品孔的讀值為負(fù)數(shù),，但接近零點(diǎn),，小編看了一下客戶標(biāo)曲的0點(diǎn)OD值接近0,，初步判斷客戶是用空白孔進(jìn)行校準(zhǔn)，但空白孔由于操作污染等原因,，OD值偏高,，進(jìn)而導(dǎo)致樣品孔OD值為負(fù)。跟客戶溝通之后,，確實(shí)是進(jìn)行了空白孔校準(zhǔn),。

溝通之后，確認(rèn)原始空白孔讀值為0.0962,，明顯偏高,，正常OD450的空白孔讀值應(yīng)為0.06左右。

在這里,，小編建議有條件的小伙伴,，盡量要用我們推薦的雙波長校正法，使用570或630nm波長進(jìn)行校正,，OD450 - OD570/630即為校正后的OD值,，可直接用于計(jì)算，也可根據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)量,，再進(jìn)行空白校正,。如沒有雙波長的酶標(biāo)儀，讀取OD450數(shù)據(jù)后,，應(yīng)先判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量,，再進(jìn)行空白校正。

小編將空白校正進(jìn)行補(bǔ)回,，得到的OD450原始數(shù)據(jù)如下：至此,，樣品孔數(shù)據(jù)出現(xiàn)負(fù)值這一問題解決。

圖三. 經(jīng)還原處理的OD450原始數(shù)據(jù)圖

2. 標(biāo)曲擬合問題

處理完了負(fù)值問題,，還有一個很明顯的問題就是,，客戶的標(biāo)曲擬合問題。我們這款試劑盒（Mouse TNF alpha ELISA Kit,，abs520010）標(biāo)曲最高點(diǎn)是2000 pg/ml,，客戶給我的截圖（圖二）只到250 pg/ml，再仔細(xì)研究一下,，發(fā)現(xiàn)客戶的擬合方式用的竟然是直線擬合,。跟客戶溝通之后，確認(rèn)原因,，客戶選擇直線擬合,，高點(diǎn)不符合擬合方式，R²值過低,，所以客戶自己把上面高濃度的點(diǎn)去掉了,，只選取到250 pg/ml,，進(jìn)行直線擬合。在這里,，小編強(qiáng)調(diào)一下,， 愛必信ELISA試劑盒推薦擬合方式為四參數(shù)擬合,，四參數(shù)擬合,，四參數(shù)擬合，重要的事情說三遍,。不要再用其他稀奇古怪的擬合方式進(jìn)行擬合啦,。就像這個客戶犯的錯誤，雖然看似250 pg/ml以下的點(diǎn)可以用直線擬合,，但是表達(dá)含量較高的樣品,，OD值高時，就不符合他擬合的這條直線了,，會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重偏差,。由于0孔出現(xiàn)問題，小編在擬合標(biāo)曲時,，將OD值最低的孔作為空白孔,，TNF-α在正常樣品中表達(dá)含量極低，可視為0,，擬合曲線如下：

圖四. 四參數(shù)擬合的曲線圖及方程

回歸計(jì)算之后得到樣品濃度,，部分無法計(jì)算出的樣品孔，表達(dá)含量低于0點(diǎn),，按0計(jì)算即可,。