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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,， ELISA)于1971年分別由瑞典學(xué)者和荷蘭學(xué)者報(bào)道，開(kāi)創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法,。其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記,。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，由此進(jìn)行定性或定量分析。該實(shí)驗(yàn)因其靈敏度較高,，特異性較好,，操作較簡(jiǎn)單，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中,。然而,，“花板”現(xiàn)象的出現(xiàn)，往往會(huì)給實(shí)驗(yàn)者判讀結(jié)果帶來(lái)麻煩,。所謂“花板”,，就是空白、陰性,、陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高，弱陽(yáng)性結(jié)果較多,。筆者對(duì)“花板”現(xiàn)象進(jìn)行了分析和總結(jié),，認(rèn)為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌,，孵育和顯色過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致,。 1 花板原因大多在樣品 所謂“花板”，就是空白,、陰陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高。之所以空白,、對(duì)照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常,，是因?yàn)闃悠繁旧淼脑?，大部分或全部?biāo)本孔的OD值偏高，很可能是因?yàn)闃悠分心承┕灿械奈镔|(zhì)非特異性的吸附于固相載體,，而在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中未被除去,。 1.1 待測(cè)血清中混有紅細(xì)胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，李文,，卓瑪?shù)热耍?,2］實(shí)驗(yàn)表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長(zhǎng)的離心時(shí)間(>10 min)之下,，血液標(biāo)本被充分地離心分離之后，使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀,，可以在加樣時(shí)避免加入紅細(xì)胞和纖維蛋白,，避免這兩種干擾物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，就可避免“花板”情況,。 1.2 高IgG血癥 在實(shí)際工作中,，筆者發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)丙肝的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)花板的情況較多,，原因之一是因?yàn)槟壳皣?guó)內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)原理,，間接法的一個(gè)重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對(duì)聚苯乙烯有較強(qiáng)的吸附力,，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽(yáng)性,。 2 解決辦法主要在洗滌 聚苯乙烯因其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實(shí)驗(yàn)的固相載體，聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，因此需要通過(guò)洗滌清除在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗,。上述提到的血清中存在紅細(xì)胞或纖維蛋白原，可以在加樣前離心時(shí)得到控制,，同樣也可以通過(guò)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時(shí)間減輕或避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,，同樣，對(duì)于血液存在的非特異性的IgG,實(shí)驗(yàn)者很難在加樣時(shí)將其去除,，那么解決的最佳時(shí)機(jī)就是洗滌過(guò)程,。 ELISA在洗滌過(guò)程中需注意以下幾點(diǎn)：(1)板要平整，尤其是在用洗板機(jī)洗板的過(guò)程中,，往往是3排一起洗,，如果板不平，就很可能造成洗液有殘留,，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈,，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。(2)洗液溫度,，肖靜［3］實(shí)驗(yàn)表明,，洗液溫度也會(huì)影響洗板的干凈程度,，尤其是冬天溫度過(guò)低時(shí)容易出現(xiàn)“花板”問(wèn)題。因此,，最好保持室溫在20℃-30℃,。(3)洗液要注滿(mǎn)孔，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板”現(xiàn)象,。(4)洗液要新鮮配置,，洗液要臨用前新鮮配制，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易產(chǎn)生絮狀物或混濁,，造成賭孔或花板,。(5)洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時(shí)間過(guò)短也會(huì)造成由于洗板不凈而造成“花板”。 3 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成“花板” 本實(shí)驗(yàn)室曾有一段時(shí)間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測(cè)“花板”現(xiàn)象,，究其原因是由于樣本較多,，加樣后未及時(shí)放入孵育箱，反應(yīng)板在室溫呆的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，即間接增加了孵育時(shí)間,，導(dǎo)致孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體,。因此,，應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時(shí)間，加樣后及時(shí)孵育,，標(biāo)本較多時(shí)可分批操作,。 此外，有些廠(chǎng)家的試劑顯色液不穩(wěn)定,，使用前容易變藍(lán),，如在實(shí)驗(yàn)前不仔細(xì)檢查，很容易導(dǎo)致“花板”現(xiàn)象的發(fā)生,，這也提醒實(shí)驗(yàn)者應(yīng)使用新鮮的顯色液,，最大程度的保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 綜上所述,，筆者根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn),，并通過(guò)閱讀文獻(xiàn)，將ELISA“花板”現(xiàn)象總結(jié)為：花板原因大多在樣品,，解決辦法主要在洗滌,，孵育和顯色過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致。既然原因大多在樣品,，那么在樣品交接時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,，無(wú)溶血，無(wú)凝血，足量,，單個(gè)的溶血樣品雖不致造成“花板”,，但血紅蛋白中的血紅素基團(tuán)，具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性,，在以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中,，易在孵育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色,，從而造成假陽(yáng)性,。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟，充分有效的洗滌也是避免“花板”的有利措施,。同樣,，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明孵育，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板”的保障,。以上措施可以有效減少“花板”次數(shù),，從而提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢(shì),。 參 考 文 獻(xiàn) ?。?］李文，王麗紅.ELISA HbsAg試劑“花板”問(wèn)題的解決.中國(guó)輸血雜志,，2004,，17:106. ［2］ 卓瑪.對(duì)ELISA法檢測(cè)HbsAg出現(xiàn)“花板”問(wèn)題原因的分析.第九屆西北五省(區(qū))檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編,，319. ?。?］ 肖靜.ELISA試劑“花板”問(wèn)題的出現(xiàn)與分析.中國(guó)論文下載中心. |
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