很多人不知道,，抗體藥物研發(fā),，最關(guān)鍵的一步是。,。,。

咨詢，問(wèn)對(duì)人很重要

一個(gè)雙特異性抗體藥與普健的故事,，四年征程,，未完待續(xù)。,。,。

那是2015年8月的一個(gè)下午,，叮咚~

一條消息跳了出來(lái),，“要開(kāi)發(fā)雙特異性抗體藥物，你們有專家嗎,？”

“我們的抗體藥物專家經(jīng)驗(yàn)豐富,，曾經(jīng)成功開(kāi)發(fā)過(guò)上市治療性抗體藥物，可以針對(duì)具體需求進(jìn)行個(gè)性化設(shè)計(jì),。AtaGenix將全程為您服務(wù),。” 

隨后,，一項(xiàng)歷時(shí)四年的工程由此展開(kāi),。

目標(biāo)：開(kāi)發(fā)一種雙特異性抗體藥物，通過(guò)連接CD3抗體,，增強(qiáng)針對(duì)某類特定腫瘤細(xì)胞A的免疫系統(tǒng)識(shí)別能力,。

要開(kāi)發(fā)雙特異性抗體，我們得先分別獲得抗單種抗原的鼠單抗---CD3抗體和腫瘤抗原A的抗體,。然后進(jìn)行雙特異性抗體設(shè)計(jì),、表達(dá)及純化，對(duì)正確組裝后的雙抗進(jìn)行檢測(cè),，最終實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),。

路得一步一步走，每一步都很關(guān)鍵,。

這就需要我們的單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)（點(diǎn)擊可查看技術(shù)詳情）,。

已知目標(biāo)蛋白在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)里很難表達(dá),，但我們就是解決困難的,。 

接下來(lái)，沿著單克隆抗體開(kāi)發(fā)流程,，看一下我們是怎樣做到的。

經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)和評(píng)估,，我們選擇了目標(biāo)蛋白的一個(gè)片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),。

雖然，該基因是針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)而設(shè)計(jì)和優(yōu)化的,。

但是,，我們向來(lái)不只做單一準(zhǔn)備，永遠(yuǎn)備有為客戶準(zhǔn)備的Plan B,。So,，除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，我們還選了大腸桿菌作為備用系統(tǒng),。兩種表達(dá)方案同時(shí)進(jìn)行,，最終獲得滿足條件的抗原。

用原始抗原免疫五只小鼠,，并篩選陽(yáng)性血清,。

為了篩選到符合要求的抗體，我們將綠色熒光蛋白GFP與抗原蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中融合表達(dá),，通過(guò)FITC信號(hào)將表達(dá)GFP的細(xì)胞篩選出來(lái),，作為流式分析抗體特異性的陽(yáng)性細(xì)胞；并使用能夠識(shí)別GFP的一抗作為陽(yáng)性抗體對(duì)照,，來(lái)篩選特異性抗體,。

流式分析檢測(cè)結(jié)果(GFP抗體和GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比)：

流式檢測(cè)中對(duì)抗原免疫原性最強(qiáng)的為3號(hào)小鼠血清，4號(hào)次之,，我們決定對(duì)小鼠3號(hào)和4號(hào)進(jìn)行融合,。

將篩選出的兩只小鼠脾細(xì)胞分別進(jìn)行融合,、亞克隆,，F(xiàn)C檢測(cè)保留最佳陽(yáng)性抗體，最終獲得最佳的30株抗腫瘤抗原A候選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,。

看一下我們都做了哪些工作?

a. 對(duì)3號(hào)小鼠細(xì)胞融合后的上清,，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，從中篩選出42株陽(yáng)性細(xì)胞株（下表）,。

b. 對(duì)3號(hào)小鼠細(xì)胞融合后的上清,，進(jìn)行FC檢測(cè),，從中篩選出14株陽(yáng)性細(xì)胞株（下表）。

c. 生產(chǎn)的抗體,，進(jìn)行FC檢測(cè),，從中篩選出30株陽(yáng)性細(xì)胞株（下表）。

抗腫瘤抗原A雜交瘤測(cè)序獲得鼠單抗的VH和VL序列。

做了8個(gè)嵌合抗體的表達(dá)純化,，將8個(gè)嵌合抗體和1個(gè)原始雜交瘤細(xì)胞純化得到的抗體進(jìn)行ELISA驗(yàn)證,，用Biacore檢測(cè)了這9個(gè)抗體的親和力，篩選到了高親和力的嵌合抗體,。

表達(dá)了18個(gè)人源化抗體,，將18個(gè)人源化抗體、原始雜交瘤細(xì)胞純化得到的抗體及篩選得到的最佳嵌合抗體,，進(jìn)行ELISA驗(yàn)證,，用Biacore檢測(cè)了這20個(gè)抗體的親和力，篩選得到高親和力抗體,。

接下來(lái),，是最關(guān)鍵的一步。別眨眼哦,！

目標(biāo)：抗腫瘤抗原A和CD3的雙特異性抗體

我們已獲得3個(gè)抗腫瘤抗原A抗體,，1個(gè)抗CD3抗體。

AB1（前期項(xiàng)目中開(kāi)發(fā)并測(cè)序的小鼠雜交瘤單克隆抗體）

AB2和AB3（通過(guò)噬菌體展示開(kāi)發(fā)的人源單克隆抗體）

AB4 （AB4h）是在專利中公開(kāi)的的抗CD3人源化抗體

我們的抗體設(shè)計(jì)專家設(shè)計(jì)了3種類型的雙特異性抗體,，即CrossMAb,，IgG-like format using DuoBodies，and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format,。 

將cDNA序列亞克隆到AtaGenix特有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pTXs1中,，本項(xiàng)目共使用21個(gè)表達(dá)質(zhì)粒（下表）：

總共16種抗腫瘤抗原A和抗CD3的重組抗體片段用于測(cè)試。

表達(dá)測(cè)試結(jié)果如下：

CrossMAbs類型重組抗體表達(dá)純化測(cè)試

結(jié)果表明,，CrossMAbs是表達(dá)的,，但沒(méi)有以完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)組裝,，處于半形成狀態(tài)。

DuoBodies類型重組抗體表達(dá)純化測(cè)試

No.7: AB1重組抗體,；No.8: AB2重組抗體,；No.9: AB3重組抗體；No.10: AB4重組抗體

Bivalent Fab-Fab類型重組抗體表達(dá)純化測(cè)試

重組抗體QC結(jié)果（還原膠和非還原膠）

結(jié)果顯示,，對(duì)于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體類型,，正確地產(chǎn)生了完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)。

值得一提的是,，我們整個(gè)表達(dá)純化過(guò)程對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行了有效的控制和去除,，將內(nèi)毒素控制在<0.1EU/mg。

上面獲得的DuoBodies類型重組抗體,，目前只能特異識(shí)別單一抗體，如何將兩種抗體組合連接,，就需要神奇的Fab臂交換技術(shù),。

通過(guò)特定的條件，進(jìn)行Fab臂交換重組抗腫瘤抗原A抗體和抗CD3抗體,，形成雙特異性抗體,。

對(duì)交換重組的雙特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)：

重組DuoBodies抗體QC結(jié)果（還原膠和非還原膠）

1：No.7+No.10；2：No.8+No.10,；3：No.9+No.10

重組DuoBodies抗體產(chǎn)量及純度

5.1）SEC-HPLC Analysis

SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果表明,，No.7+No.10重組雙特異性抗體濃度最高，是由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成的理想雜合四聚體,。No.8+No.10重組抗體有一些降解或未組裝完全,，No.9+No.10重組抗體顯著降解或組裝較少。

5.2）ELISA滴定

ELISA滴定法同時(shí)測(cè)定雙特異性抗體和以前獲得的親本抗體(AB1,、AB2和AB3)對(duì)腫瘤抗原A和CD3的結(jié)合能力,。

針對(duì)腫瘤抗原A結(jié)合檢測(cè)

針對(duì)CD3結(jié)合檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果顯示，所有陽(yáng)性對(duì)照與預(yù)期一致,。

DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體與腫瘤抗原A和CD3結(jié)合良好,，說(shuō)明這兩類重組雙特異性抗體構(gòu)建正確。雖然CrossMAbs類型抗體也會(huì)結(jié)合,，但它們的結(jié)合很可能是由半合成狀態(tài)的抗體造成的,。

項(xiàng)目的順利推動(dòng)，其中包含2000多封郵件溝通,，30多個(gè)技術(shù)人員辛勤實(shí)驗(yàn),，歷時(shí)4年，中法科學(xué)家通力合作,。

目前,，其中一個(gè)雙特異性抗體已經(jīng)完成開(kāi)發(fā),，生產(chǎn)并交付客戶1.237g抗體。接下來(lái),，客戶計(jì)劃采用我們擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞株進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建,，后續(xù)事宜正在商定中。