雙特異性抗體（bsAb）因可同時特異性結(jié)合2 個不同抗原表位,，拓展了治療性單克隆抗體的臨床應(yīng)用范圍,。制備bsAb 需要對傳統(tǒng)的抗體結(jié)構(gòu)進行改造，在此過程中衍生出了數(shù)十種結(jié)構(gòu),，不同的結(jié)構(gòu)具有不同的作用特點,。當(dāng)前典型的bsAb 結(jié)構(gòu)及其原理進行介紹，對bsAb 的作用原理進行分析,，并對當(dāng)前代表性的bsAb 的研發(fā)階段進行了簡單總結(jié),。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）為可以同時特異性結(jié)合2 個抗原或抗原表位的單一抗體分子,，通過該作用特點,，達到同時阻斷2 個抗原/ 表位介導(dǎo)的生物功能或?qū)⒈磉_2 種抗原的細(xì)胞拉近而增強兩者間相互作用的目的。bsAb 的概念出現(xiàn)在20世紀(jì)80 年代,，Morrison 等首先通過將不同特異性的單鏈抗體使用柔性肽段連接后融合表達的方式制備了第1 種真正意義上的抗葡聚糖和丹磺?；乃膬rbsAb。由于技術(shù)瓶頸和臨床需求不足的限制,，bsAb的發(fā)展一直受到阻礙,。隨著對疾病發(fā)病機制的深入了解，臨床上產(chǎn)生了對bsAb 的需求,，同時治療性單克隆抗體（monoclonal antibody,，McAb）的飛速發(fā)展大大提高了抗體的構(gòu)建,、表達和純化技術(shù)，使bsAb 發(fā)展具備了克服限制因素的技術(shù)和動力,。目前bsAb 已經(jīng)發(fā)展出近70 種結(jié)構(gòu),，包括Triomab、BiTE,、Crossmab,、Double Variable Domain（DVD）等，此外還包括多種確保形成正確bsAb 結(jié)構(gòu)的技術(shù),。根據(jù)不同治療機制和臨床需求,，bsAb 采用相應(yīng)的結(jié)構(gòu)，因此也可以說多樣性的需求催生了多樣性的bsAb 結(jié)構(gòu),。截至2016 年,，據(jù)不完全統(tǒng)計，已有30 余個bsAb 進入臨床試驗,，適應(yīng)癥主要為腫瘤和自身免疫性疾病,。目前已批準(zhǔn)上市的bsAb 包括Catumaxomab 和Blinatumomab，前者采用Triomab 結(jié)構(gòu)用于治療上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion moleculer,，EpCAM）陽性上皮源性轉(zhuǎn)移腫瘤所導(dǎo)致的惡性腹水,，后者采用BiTE 結(jié)構(gòu)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病。本文將就bsAb 的結(jié)構(gòu),、功能和應(yīng)用方面進行介紹,。

1.bsAb 結(jié)構(gòu)

為實現(xiàn)能夠同時特異性結(jié)合2 個不同抗原表位的能力，多數(shù)bsAb 通過結(jié)構(gòu)設(shè)計包含了2 個不同的抗原結(jié)合部位（可變區(qū)）,。當(dāng)前有近70 種bsAb 結(jié)構(gòu)（圖1）,，多數(shù)通過改造IgG 獲得，少數(shù)通過化學(xué)偶聯(lián)或與其他蛋白融合表達獲得,。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點,，bsAb 大致可以分為5 類（圖1），包括IgG 樣bsAb,、含附加可變區(qū)的IgG 樣bsAb,、串聯(lián)不同抗原結(jié)合片段的bsAb、融合蛋白型bsAb,、化學(xué)偶聯(lián)bsAb,。多數(shù)bsAb 為雙價和四價，少數(shù)可達六至八價,，下面將就幾種典型的bsAb 結(jié)構(gòu)予以介紹,。

1.1 IgG 樣bsAb

采用重組DNA 技術(shù)可以通過結(jié)構(gòu)改造構(gòu)建bsAb。通過結(jié)構(gòu)改造構(gòu)建的免疫球蛋白G（immunoglobulinG,，IgG）樣bsAb 具有完整的可結(jié)晶片段（Fc 片段）［crystallizable fragment（ Fc fragment）］,，因此該類bsAb在結(jié)合不同抗原的同時,，仍保留了Fc 片段所介導(dǎo)的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)（antibody-dependentcellmediated cytotoxicity，ADCC）,、補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)（complement-dependent cytotoxicity,，CDC）等功能，同時該類IgG 也保留了通過與新生兒Fc 受體（neonatal Fc receptor,，F(xiàn)cRn）結(jié)合延長抗體體內(nèi)半衰期的特點,。但該類bsAb 制備中面臨著確保重鏈-重鏈和重鏈- 輕鏈正確配對的問題，通過Triomab,、Knob-in-hole（KiH）、離子橋,、SEED等技術(shù)可提高重- 重鏈正確配對比例,，采用二硫鍵、離子橋,、Crossmab等技術(shù)可提高重- 輕鏈正確配對的比例,。

1.1.1 重鏈- 重鏈的正確配對

由于重鏈在與抗原結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用，不同重鏈間正確配對是構(gòu)建bsAb 的前提,。采用四雜交瘤（Quadroma）技術(shù),，融合2 種雜交瘤細(xì)胞可制備IgG 樣的bsAb。由于四雜交瘤細(xì)胞中不同重鏈和輕鏈間為隨機配對,，目的bsAb 在總抗體中僅占10%~20%,，且由于目的bsAb 同副產(chǎn)物之間理化性質(zhì)非常相似，使該類抗體難于純化,。為提高bsAb 正確組裝的效率,，Staerz 等利用小鼠IgG2a 與大鼠IgG2b 分子Fc 片段間易于形成異源二聚體的特點，通過將分泌IgG2a 亞類抗白細(xì)胞分化抗原3（cluster of differentiation 3,，CD3）的小鼠雜交瘤細(xì)胞與分泌IgG2b 亞類抗胸腺細(xì)胞分化抗原1.1（thymocyte differentiation antigen1.1,，Thy-1.1）大鼠瘤細(xì)胞進行二次融合，構(gòu)建了改良的四雜交瘤細(xì)胞,，使目的bsAb 的比例大大提高,。采用該技術(shù)制備的bsAb 除可以通過不同的抗原結(jié)合片段（antigen binding fragment，F(xiàn)ab）分別結(jié)合2 種不同抗原外,，還可通過其Fc 片段與位于多種免疫細(xì)胞表面的Fc 受體結(jié)合,，介導(dǎo)免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷，因此認(rèn)為該種bsAb 具有3 個結(jié)合位點,，故又將該結(jié)構(gòu)的bsAb 稱為Triomab,。利用該技術(shù)，Trion Pharma 和Fresenius Biotech 研發(fā)了EpCAM+CD3（Catumaxomab）,、HER2+CD3（Ertumaxomab）,、CD20+CD3（FBTA05）等多種bsAb,，其中Catumaxomab 被歐盟批準(zhǔn)用于惡性腹水的治療，Ertumaxomab 和FBTA05 目前也已經(jīng)完成了針對乳腺癌和B 淋巴細(xì)胞瘤的Ⅱ期臨床試驗,。

Triomab bsAb 為鼠源性抗體,，為降低潛在的嚴(yán)重免疫原性風(fēng)險，研究人員希望通過結(jié)構(gòu)改造構(gòu)建人源IgG 樣bsAb,。根據(jù)抗體的CH3 介導(dǎo)重鏈二聚體的形成這一功能特點,，分別對2 條重鏈的CH3 進行改造，通過電荷排斥/ 吸引作用或空間位阻作用,，可使不同CH3 傾向于形成異源二聚體的方式構(gòu)建bsAb,，利用電荷排斥/ 吸引作用或空間位阻作用改造CH3 的技術(shù)分別稱為離子橋技術(shù)和Knob-in-Hole（KiH）技術(shù)。結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),，2 條重鏈CH3 間的E356-K439,、E357-K370、D399-K409 通過電荷吸引作用在二聚體的形成中起主要作用,，因此,，改變這些位置的氨基酸電荷狀態(tài)可影響二聚體的形成。在重鏈A 中引入K370E,、K409D,、K439E 中的至少2 個突變，重鏈B 中引入E356K,、E357K,、D399K 突變，可以抑制同源二聚體形成并促進重鏈異源二聚體的形成,。在進一步的改造嘗試中,，在重鏈A 中進行K409D 突變，重鏈B 中進行D339K 突變,，即可高效形成異源二聚體,。該類突變理論上可以通過電荷排斥作用抑制同源二聚體的形成，但在實際操作中,，重鏈同源二聚體的比例仍然較高,。繼續(xù)向重鏈A 中引入K392D，向重鏈B 中引入E356K 突變,，不僅不能進一步增加異源二聚體的比例,，反而使表達量明顯下降。也就是說,，向bsAb 抗體中引入更多的離子對型突變不僅不能如理論預(yù)期中增加抗體重鏈正確配對的能力,，反而可能影響抗體產(chǎn)量并可能增加免疫原性。除改變2 條重鏈的電荷使其形成異源二聚體外,，Moore 等還通過結(jié)構(gòu)模擬等方式指導(dǎo)突變,，篩選結(jié)果表明重鏈A 的A364H,、F405A（HA）突變和重鏈B 的Y349T、T394F（TF）突變可以提高異源二聚體形成效率,，該突變方式與離子對突變方式獲得的異源二聚體比例相當(dāng),，可達89%。利用空間位阻效應(yīng),，Genentech公司提出了Knob-in-Hole 方式制備bsAb 的技術(shù),，在Knob 鏈中引入S354C、T366W 突變,，在Hole 鏈中引入Y349C,、T366S、L368A,、Y407V 突變,，通過空間位阻增加重鏈異源二聚體形成比例的同時，采用二硫鍵穩(wěn)定已經(jīng)形成的異源二聚體,，使Konb-in-Hole 抗體的比例達到約97%,。

Davis 等發(fā)現(xiàn)人IgG 和IgA 的CH3 區(qū)不能彼此結(jié)合,，而將結(jié)構(gòu)相似的beta 鏈片段置入后兩者可以形成IgG 樣的異源二聚體,，將該類bsAb 稱為SEED（strand exchanged engineered domain，SEED）抗體,。利用該原理,，Muda 等在西妥昔（Cetuximab）的基礎(chǔ)上開發(fā)了一系列bsAb，但關(guān)于該技術(shù)的具體應(yīng)用尚未見后繼報道,。Wranik 等發(fā)明了“LUZ-Y”結(jié)構(gòu)的bsAb,，該模式中，通過使用柔性肽段連接重輕鏈的方式確保重輕鏈配對的同時,，采用在重鏈末端融合表達亮氨酸拉鏈的方式確保異源二聚體的形成,。

通過四雜交瘤或CH3 改造技術(shù)可有效確保bsAb 異源重鏈之間的正確配對，在此基礎(chǔ)上,，重輕鏈之間的正確配對成為擺在bsAb 開發(fā)者前面的另一個重要障礙,。

1.1.2 重鏈- 輕鏈的正確配對

目前開發(fā)了多種確保重鏈- 重鏈正確配對的技術(shù)，可以使重鏈異源二聚體的比例占比達到90% 左右,，但若不通過一定手段確保重鏈- 輕鏈間的正確配對,，則隨機配對產(chǎn)生的抗體中，目的bsAb 的含量僅占25%,。因此,，研究人員進一步開發(fā)了多種技術(shù)以確保重輕鏈間的正確配對。

首先想到的方式為模仿KiH 技術(shù),，對重輕鏈作用表面的氨基酸進行改造,。Zhu 等通過在2 對重輕鏈組合的輕鏈中分別引入Y87A 或F98M 突變,，對應(yīng)的重鏈分別引入V37F 或L45W 突變，可以確保不同特異性的重輕鏈間的正確配對,，但該方式不具有廣泛的適用性而僅適用于作為實驗對象的抗體,。由于VL-CL/VH-CH 為異源二聚體，且VL-CL/VH-CH的結(jié)構(gòu)多變,，因此通過氨基酸突變來確保重輕鏈間正確配對的難度較大,。另一種確保重輕鏈間正確配對的方式為采用共有輕鏈。由于重鏈,，特別是重鏈的互補決定區(qū)（complementarity-determiningregion,，CDR）3 在抗體的特異性和親和力中發(fā)揮決定性作用，而輕鏈則為輔助作用,，因此,，對輕鏈的要求較低，通過噬菌體展示技術(shù),，可以在固定輕鏈的情況下,，篩選具有不同特異性的重鏈用于bsAb 的構(gòu)建。通過共有輕鏈,，Jackman 等構(gòu)建了針對Fcε 受體Ⅰ（FcεRⅠ）和Fcγ 受體Ⅱb（FcγR Ⅱb）的bsAb,。雖然共有輕鏈技術(shù)不存在重輕鏈錯配的問題，但該結(jié)構(gòu)bsAb 的開發(fā)難度大,，且不能確保所有的抗原配對均能篩選到合適的共有輕鏈,，因此至今未見采用該結(jié)構(gòu)的bsAb進入臨床。

當(dāng)前最常用的促進bsAb 中重輕鏈正確配對的技術(shù)為Genentech 開發(fā)的Crossmab 技術(shù),，由于CLCH1間可通過結(jié)構(gòu)互補作用形成異源二聚體,，且CL-CL 和CH1-CH1 間具有排斥作用，因此通過將bsAb 的1 個Fab 臂中的VL-VH 或CL-CH1 在重輕鏈間進行互換,，另1 個Fab 臂不進行改動,，這樣形成的VH-CL 或VL-CH1 輕鏈與正常的VH-CH1間相互排斥，可在一定程度上避免2 條Fab 臂中輕鏈的錯配,。Crossmab bsAb 的組裝過程中也會有部分副產(chǎn)物產(chǎn)生,，如VL-VH 的互換可能會形成VHCL+VH-CH1 的錯配產(chǎn)物，而CL-CH1 的互換可能會形成VL-CH1+VL-CL 的副產(chǎn)物,。雖然有上述副產(chǎn)物的產(chǎn)生,，在采用異源輕鏈構(gòu)建的bsAb 中，使用Crossmab 技術(shù)仍可獲得很高的重輕鏈正確配對比例,。此外,，對Crossmab bsAb 的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域的交換對bsAb 的活性、穩(wěn)定性和表達效率沒有產(chǎn)生顯著影響,。利用Crossmab 技術(shù),，Genentech 構(gòu)建了抗Ang-2/VEGF bsAb，可同時抑制2 種血管生成因子的生物學(xué)作用,，在腫瘤和年齡相關(guān)濕性黃斑變性（agerelated maculardegeneration,，AMD）治療中的效果好于單獨使用2 個母抗體的治療效果，目前該抗體已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗,。

1.2 含附加可變區(qū)的IgG 樣bsAb

通過融合蛋白的方式,，在重鏈和/ 或輕鏈上增加其他特異性的抗原結(jié)合片段，可以將傳統(tǒng)IgG 改造為bsAb,。增加的抗原結(jié)合片段可以為單域抗體,、單鏈抗體或其他的抗原結(jié)合蛋白，稱為附加可變區(qū),。含附加可變區(qū)的IgG 樣bsAb 的最簡單形式為在重鏈或輕鏈的N 端或C 端融合單鏈抗體或單域抗體的結(jié)構(gòu)形式,。除上述結(jié)構(gòu)形式之外，附加可變區(qū)IgG樣bsAb 的另1 種結(jié)構(gòu)形式為雙可變區(qū)（dual variable domain,，DVD）IgG,，即通過在IgG 的重鏈和輕鏈的N端分別增加1 個其他特異性抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，使抗體可以特異性結(jié)合2 個不同抗原,。在DVD 技術(shù)基礎(chǔ)上結(jié)合與KiH 和Crossmab 技術(shù)還可以制備四特異性抗體,。這種結(jié)構(gòu)的bsAb 可以避免IgG 樣結(jié)構(gòu)bsAb 中存在的重鏈- 重鏈和重鏈-輕鏈錯配的問題。目前Abbvie&Abott 公司的DVD結(jié)構(gòu)bsAb 的構(gòu)建技術(shù)較為成熟,，該企業(yè)開發(fā)的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的IL17+TNFa DVD-IgG 和用于治療骨性關(guān)節(jié)炎的IL1α+IL-1β DVD-IgG 均已完成Ⅱ期臨床試驗,。

1.3 片段連接bsAb

串聯(lián)片段bsAb 為通過連接肽將不同的Fab,、單鏈抗體,、單域抗體或抗原結(jié)合片段等結(jié)構(gòu)以一定的排列順序予以連接而獲得的bsAb，片段連接bsAb的VH-VL 正確配對需借助多種機制,，包括連接肽（BiTE,、scDiabody 等）、二硫鍵（miniantibody）,、CH3KiH（sc-Diabody-CH3,、scFV-CH3）等。該類抗體由于缺乏恒定區(qū),，特別是缺乏Fc 片段,，半衰期較短，而且其表達量和表達后的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性一般低于傳統(tǒng)IgG,。同時,，多數(shù)的該類抗體在純化過程中難以采用親和純化手段，因此其純化工藝和成品中的雜質(zhì)分析也較傳統(tǒng)IgG 復(fù)雜,。

由于片段連接bsAb 體內(nèi)半衰期短,，活性阻斷為治療機制的bsAb 不適合采用該類設(shè)計,。片段連接bsAb 多為一端抗腫瘤特異性/ 相關(guān)抗原，另一端抗CD3 抗體,，通過將T 細(xì)胞招募至腫瘤細(xì)胞周圍并激活,，借助T 細(xì)胞殺傷效應(yīng)達到治療效果，與此同時,，還可在一定程度上獲得免疫記憶效應(yīng),，其中最典型的為Amgen 制備的Blinatumomab。該BiTEbsAb 通過柔性肽段將CD19 和抗CD3 scFv 連接,，通過招募T 細(xì)胞至CD19+ 的B 淋巴瘤細(xì)胞周圍達到治療作用,，Blinatumomab 目前已被FDA 批準(zhǔn)用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療，并表現(xiàn)出良好的療效,。

1.4 融合蛋白型bsAb 和化學(xué)偶聯(lián)型bsAb

融合蛋白型和化學(xué)偶聯(lián)型bsAb 結(jié)構(gòu)上具有相似性,，均為通過連接子（蛋白、連接分子等）將不同特異性的抗體/ 抗體片段（IgG,、Fab,、scFv 等）進行連接，形成可同時結(jié)合2 個或以上抗原的蛋白分子,。

融合蛋白型bsAb 與片段連接型bsAb 不同,，后者通過柔性的連接肽連接2 個抗原結(jié)合蛋白，連接肽僅具有保持分子完整性的功能,，而融合蛋白型bsAb中,，2 個抗原結(jié)合蛋白融合于載體蛋白上，載體蛋白除確保分子完整性外,，還具有其他功能,，如，抗體與白蛋白融合后可延長抗體片段的半衰期,，抗CD3抗體與T 細(xì)胞受體融合后可以拓展T 細(xì)胞的識別范圍,。

化學(xué)偶聯(lián)型bsAb 中，首先需分別制備2 個抗體/ 抗體片段后,，通過化學(xué)鍵將兩者偶聯(lián)或?qū)烧咄瑫r與載體蛋白偶聯(lián),，其制備過程本身增加了產(chǎn)物的復(fù)雜性，增加了產(chǎn)品的質(zhì)控難度,。最近新發(fā)展起來的一種化學(xué)偶聯(lián)型bsAb 結(jié)構(gòu)為CovX-Body,，該結(jié)構(gòu)中，通過將1 個具有治療作用的小的抗原結(jié)合肽與已有抗體偶聯(lián),，構(gòu)建bsAb 的同時,，延長了抗原結(jié)合肽的半衰期。

2.部分已批準(zhǔn)的和進入臨床試驗階段的bsAb

表1 列出了部分已經(jīng)批準(zhǔn)上市和當(dāng)前處于臨床階段的bsAb。

3 bsAb 效應(yīng)

3.1 招募免疫效應(yīng)細(xì)胞

細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes,，CTL）在抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有重要作用,，但腫瘤細(xì)胞可通過多種機制逃避免疫細(xì)胞的攻擊?？笴D3+ 抗腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen,，TSA）/ 腫瘤相關(guān)抗原（tumor association antigen，TAA bsAb 可通過其獨特的功能,，招募免疫效應(yīng)細(xì)胞,，特別是CTL，至腫瘤細(xì)胞周圍,，增加兩者的接觸,，使免疫效應(yīng)細(xì)胞短暫激活并殺傷腫瘤細(xì)胞。除CTL 外,，具有Fc 片段的bsAb 還可以招募自然殺傷（natural killer,，NK）細(xì)胞（CD16a）、單核細(xì)胞（CD32a）和粒細(xì)胞（CD64）,，增強抗腫瘤免疫效應(yīng),。該類bsAb較多，其結(jié)構(gòu)形式也多種多樣,，如抗EpCAM+CD3的Catumaxomab（Triomab）,、抗CD19+CD3 的Blinatumomab（BiTE）和抗CD123+CD3 的MGD006（DART）等。

3.2 阻斷生長/ 增殖信號傳導(dǎo)通路

在部分腫瘤中,，細(xì)胞表面的生長因子受體及其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腫瘤的形成和維持,，如HER2、EGFR 等,，阻斷這些受體可以抑制腫瘤的生長,。在部分腫瘤中，可能多種受體同時參與了腫瘤的形成,，此時,，需要同時阻斷2 種或2 種以上受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程以達到更好的治療效果,。如抗HER2+HER3 的MM-111（HSA 融合bsAb）,、抗IGF-1R+HER3 的MM-141（scFv-IgGs）、抗EHFR+HER3的Duligotuzumab（DAF）等,。

3.3 阻斷腫瘤新生血管生成

新生血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的重要促進因素之一,，多個血管生成因素參與了該過程，包括血管生成因子受體2（vein endothelial growth factor receptor,，VEGFR）,、VEGFR3、VEGFA、angiopoietin-2（Ang-2）,、血小板衍化生長因子（platelet-derived growth factors,，PDGFs）等。根據(jù)目前的研究結(jié)果,，VEGFA 和Ang-2 在腫瘤新生血管的生成中起到了重要作用,。RG7221 為Crossmab 結(jié)構(gòu)的抗VEGFA+Ang-2 bsAb，目前已經(jīng)進入臨床Ⅱ期,。

3.4 阻斷細(xì)胞因子

多種細(xì)胞因子參與了自身免疫病的發(fā)生,，如TNFa、IL-6,、IL-17,、IL-1、IL-12 等,。bsAb 可以同時阻斷2 種或2 種以上細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng),，在部分自身免疫性疾病的治療中具有獨特的優(yōu)勢，如抗IL-13+IL-4 的SAR156597（scFv-IgG）,、抗IL-6R+HSA 的ALX-0061（Nanobodies）和抗TNFa+IL-17 的ABT-122（DVD）等,。

由于bsAb 的特點，其在腫瘤,、自身免疫病和炎癥性疾病等方面表現(xiàn)出極大的臨床應(yīng)用前景,，同時結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性使其在設(shè)計、生產(chǎn)和質(zhì)控中存在很大的難點,。雖然目前僅批準(zhǔn)了2 個bsAb,，但數(shù)十個在研bsAb 已經(jīng)進入臨床研究階段，其中數(shù)個制品展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,，相信隨著越來越多的bsAb獲批上市,，相應(yīng)的技術(shù)亦會隨之建立發(fā)展和完善，并推動bsAb 產(chǎn)品進一步向前發(fā)展,。