題目：Mechanisms underlying the formation of complex color patterns on Nigella orientalis (Ranunculaceae) petals

刊名：New Phytologist

作者：Xiaofeng Yin, Hongzhi Kong  et al

單位：China National Botanical Garden

日期：16 December 2022

01

摘要

花瓣上復(fù)雜的顏色圖案在開花植物中很普遍,，但它們形成的潛在機(jī)制在很大程度上仍不清楚,。

在這里，通過進(jìn)行詳細(xì)的形態(tài)學(xué),、解剖學(xué),、生化、光學(xué),、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能研究,，我們研究了東方黑種草花瓣上復(fù)雜顏色圖案形成的細(xì)胞基礎(chǔ)、顯色物質(zhì),、反射光譜,、發(fā)育過程和潛在機(jī)制。

我們發(fā)現(xiàn),，毛茛科東方黑種草花瓣顏色圖案的復(fù)雜性體現(xiàn)在多個層面,，其中不同色素細(xì)胞的數(shù)量和排列是關(guān)鍵。我們還發(fā)現(xiàn),，不同顏色的顯色物質(zhì)的生物合成是連續(xù)的,，因此一種顏色/圖案會疊加在另一種顏色/圖案上。表達(dá)和功能研究進(jìn)一步表明,，一對R2R3-MYB基因協(xié)同作用以指定眉毛狀水平條紋和莫霍克發(fā)型狀飛濺的形成,。具體來說，雖然NiorMYB113-1的功能是繪制一個大的飛濺區(qū)域,，但 NiorMYB113-2作用是抑制空隙形成區(qū)域花青素的產(chǎn)生,，從而形成高度特化的圖案。

我們的研究結(jié)果為東方豬籠草花瓣著色的時空動態(tài)提供了詳細(xì)的描述,，有助于更好地理解植物復(fù)雜顏色圖案形成的機(jī)制,。

02

技術(shù)路線

Seeds of Nigella orientalis L. were purchased

Microscopy and histology

Identification and measurement of the pigments

Examination of optical properties

Reference transcriptome generation and digital gene expression (DGE) profiling

Identification of candidate genes

VIGS was applied to study the function of key candidate genes

03

主要結(jié)果

3.1 毛茛科東方黑種草花瓣顏色模式的復(fù)雜性

為了對毛茛科東方黑種草屬花瓣的顏色模式獲得一些額外的見解，我們首先進(jìn)行了更詳細(xì)的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)研究（圖1）,。我們發(fā)現(xiàn),，東方黑種草的花通常有八個花瓣，它們呈螺旋狀開始,，但在成熟時排列成“輪花”（圖1a–c）,。由于存在假蜜腺、水平條紋和其他類型的結(jié)構(gòu)和/或色素沉著,，形成了幾個同心環(huán),，因此整個花類似于所謂的“箭靶”或“靶心”（圖1c）,。

在立體顯微鏡下，單個花瓣表現(xiàn)為柄狀面狀的雙層結(jié)構(gòu),，由一個小的,、近似三角形的層狀上唇和一個大的、近似菱形的,、遠(yuǎn)端分叉的下唇組成（圖1d）,。上唇代表面部的下顎，大部分是綠色的（像莖一樣）,，但有一個小的紅色尖端,，暗示著顏色的差異。下唇是花瓣中最顯眼的部分,，它有一個綠色的近端部分,，一對反光的深綠色和眼狀假蜜腺，一條細(xì)的紅色眉毛狀水平條紋（以下稱為條紋）,，以及一個寬的飛濺區(qū)域（以下稱之為飛濺區(qū)域）,，從紅色逐漸向黃色過渡（圖1d）。由于假蜜腺,、條紋和飛濺的存在,，條紋旁邊形成了兩個幾乎水平的黃色間隙（即間隙1和2；圖1d）,，使花瓣的顏色圖案更加復(fù)雜,。

當(dāng)更仔細(xì)地檢查花瓣時，我們發(fā)現(xiàn),，盡管著色表皮細(xì)胞可分為四類（例如,，深綠色、淺綠色,、黃色和紅色）,，但它們之間的界限并不總是清晰的（圖1e–j）。此外,，雖然條紋由四到五行紅細(xì)胞組成（圖1f）,，但Splatters由超過20行紅細(xì)胞構(gòu)成，其數(shù)量和強(qiáng)度均呈肢端遞減（圖1d,，g）,。相比之下,，間隙1和間隙2的寬度分別約為10行和20行單元格（圖1f,，k）。當(dāng)檢查花瓣的橫截面和縱截面時,，很明顯,，雖然大多數(shù)細(xì)胞是黃色的,，但綠色細(xì)胞分布在莖和假蜜腺的葉肉區(qū)域，而紅色細(xì)胞幾乎只位于條紋的近軸表皮,、Splatters和上唇的頂端（圖1k–p）,。總之,，這些結(jié)果表明,，東方黑種草瓣顏色模式的復(fù)雜性在多個層面上得到反映，不同類型色素細(xì)胞的數(shù)量和排列是形成復(fù)雜顏色模式的關(guān)鍵,。

Fig. 1

3.2 東方黑種草花瓣的顯色物質(zhì)和光學(xué)特征

為了了解成熟的東方黑種草花瓣上綠色,、黃色和紅色的主要顯色物質(zhì)，我們檢查了葉綠素,、類胡蘿卜素和花青素的類型和含量（表S5）,。我們發(fā)現(xiàn)，葉綠素總量為201.99±12.40μg g-1（平均值±SD,，n=3,；下同），其中葉綠素a和葉綠素b分別占70.80%和29.20%（圖2a）,。同時,，類胡蘿卜素的總量為438.82±0.17μg g-1，其中檢測到16種不同的成分,，如葉黃素（66.74%）,、紫花素（6.47%）、新黃質(zhì)（6.00%）,、β-胡蘿卜素（4.69%）,、玉米黃質(zhì)（1.83%）和花藥黃素（1.89%）（圖2b）。花青素的總量為81.01±0.79μg g-1,，包括花青素-3-鼠李糖基-己糖基-葡萄糖醛酸苷（95.45%,，糖鍵未知，下同）和花青素-3-鼠李糖基-己糖苷（4.69%）,，但不包括天竺葵苷,、飛燕苷或其衍生物（圖2c）。顯然,，東方黑種草花瓣的綠色,、黃色和紅色的生色物質(zhì)也非常復(fù)雜。

為了評估東方豬籠草花瓣的復(fù)雜顏色圖案是否可以被傳粉者感知,，我們首先使用假彩色攝影檢查了它們的光學(xué)特征（圖2d–i）,。我們發(fā)現(xiàn)，除了總是反射的假蜜腺外,，花瓣的所有其他部分在紫外線下都呈現(xiàn)出深黑色（圖2f–g）,，這暗示了紫外線吸收,。在蜜蜂的視覺下，條紋和飛濺花呈深棕色,，而其余的花呈淡綠色（圖2h–i）,，這表明存在明顯的色差。為了更好地理解條紋和間隙之間的差異,，我們接下來測量了它們在紫外和可見光波長范圍內(nèi)的光譜反射率特性（圖2j）,。

我們發(fā)現(xiàn)，雖然當(dāng)波長在300nm和480nm之間時無法檢測到顯著差異,，但當(dāng)波長在480nm和700nm之間時,，條紋顯示出比間隙2低得多的反射率（圖2j）。通過繪制廣泛使用的蜂色六邊形模型（Chitka,，1992）中條紋和間隙2的平均反射率,，我們發(fā)現(xiàn)前者位于紫外藍(lán)色分區(qū)，而后者位于中心未著色的圓圈（圖2k）,。兩個基因座之間的距離為0.13個六邊形單位（圖2k,；數(shù)據(jù)集S1），略大于蜜蜂報(bào)告的顏色辨別值,。這表明,，條紋和縫隙確實(shí)可以被蜜蜂感知和區(qū)分，蜜蜂是該物種的假定傳粉者,。

Fig. 2

3.3 通過開發(fā)制作復(fù)雜的彩色圖案

為了了解東方黑種草花瓣上復(fù)雜的顏色圖案是如何通過發(fā)育形成的,，我們首先進(jìn)行了時間過程形態(tài)學(xué)研究（圖3a）。S4時,，花瓣呈淺綠色,，半透明（圖3a）。然后,，從S5到S9,，顏色基本上保持不變，而整個花瓣變得不透明（圖3a）,，這表明葉綠素和類胡蘿卜素生物合成活躍,。從S10開始，莖和假蜜腺區(qū)域的顏色變?yōu)樯罹G色,，而所有其他部分變?yōu)辄S色（圖3a）,，這表明花瓣不同部分的葉綠素和類胡蘿卜素代謝模式不同。此后（即,，從S11開始）,，在黃綠色和深綠色區(qū)域的幾個特定區(qū)域中，紅色開始以非常微妙的方式出現(xiàn)，這暗示了氰化物生物合成的激活,。具體而言,，位于條紋中心的細(xì)胞首先變紅（圖3a,，S11a）,，然后是條紋橫向部分的細(xì)胞（圖3a、S11b–S11c）以及莖和上唇上的細(xì)胞（見圖3a,，S11d–S11e）,。直到S12，Splatters和整個花瓣才獲得了它們的全部顏色,。

為了深入了解東方黑種草花瓣著色的分子基礎(chǔ),，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和DGE譜分析。構(gòu)建了一個共包含29901個蛋白質(zhì)編碼基因的參考轉(zhuǎn)錄組（BUSCO完整性=96.9%,，數(shù)據(jù)集S2）,，從中獲得了參與葉綠素、類胡蘿卜素和花青素生物合成的候選基因,，并根據(jù)其表達(dá)模式進(jìn)行了檢查（表S2,、S6）。正如預(yù)期的,，雖然葉綠素生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因都在花瓣發(fā)育的研究階段表達(dá),，但大多數(shù)在S10達(dá)到峰值（圖3b）。與此相反,，參與葉綠素降解的基因,，尤其是葉綠素酶（CLH）的同系物，其編碼該途徑中的第一種酶（圖3c）,，在S10,、S11或S12中的表達(dá)水平最高。總之,，這些結(jié)果表明,，葉綠素生物合成在S10之前的階段更活躍，而葉綠素的降解在之后更活躍,。此外,，與黃色的時空外觀一致，參與類胡蘿卜素生物合成的基因大多在S11和/或S12中高度表達(dá)（圖3d）,。在花青素生物合成途徑中,，除了類黃酮3'5'-羥化酶（F3'5'H）的同源物，其表達(dá)在任何取樣階段幾乎無法檢測到,，所有其他早期基因在S4–S12期間都高度表達(dá),。然而，晚期基因,，如二氫黃酮醇還原酶（DFR）的同系物和花青素合酶（ANS）,，直到S10和S11才分別表達(dá),，并且都在S12達(dá)到峰值（圖3e），這表明花青素的生物合成僅在花瓣發(fā)育的非常后期才活躍,。

值得注意的是,，只有兩個亞組6（SG6）R2R3-MYB同源物，NiorMYB113-1和NiorMYB113-2,，以及TRANSPARENT TESTA 8的同源物與花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因具有相似的表達(dá)模式（圖3e）,，這表明可能存在相關(guān)性。然而,，其他假定調(diào)節(jié)因子的表達(dá)模式既與顏色模式形成的過程不緊密相關(guān),，也與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式不相似（圖3b-e），表明它們不太可能是東方黑種草顏色模式形成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,。

總之,，這些結(jié)果表明，不同顏色的顯色物質(zhì)的生物合成是連續(xù)的,，而不是同步的,，紅色疊加在黃色上，黃色依次疊加在綠色上,。同時,，可能是因?yàn)镕3'5'H沒有表達(dá)，而F3'H的表達(dá)水平始終很高,，所以飛燕堿途徑和天竺葵堿途徑都沒有被激活,，這解釋了為什么成熟花瓣中只檢測到花青素衍生物的原因。

Fig. 3

3.4 參與顏色圖案形成的候選基因的鑒定

為了鑒定與東方黑種草花瓣上復(fù)雜顏色圖案形成相關(guān)的基因,，我們還將S11e花瓣分成七個部分（參見材料和方法,，圖4a），并進(jìn)行RNA測序,。我們發(fā)現(xiàn),，這七個部分之間的差異是明顯的（圖4b），這暗示了分化的基因表達(dá),。在18568個表達(dá)基因（數(shù)據(jù)集S3）中,，436/1848、86/197,、117/625,、196/352、80/194,、90/308和61/84個基因分別在第I–VII部分中特異性/優(yōu)先表達(dá)（圖4d–e,；數(shù)據(jù)集S4和S5）。通過研究上述途徑中涉及的基因，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),，葉綠素生物合成途徑中的大多數(shù)基因在第I–V部分中的表達(dá)水平高于第VI–VII部分（圖4c,，f；表S6）,。

另一方面,，葉綠素降解途徑中的大多數(shù)基因在第IV–V部分的表達(dá)水平最高。總之,，這些結(jié)果表明,，葉綠素的生物合成和降解在空間上是異質(zhì)的,，它們的組合活動是形成不同顏色綠色的關(guān)鍵,。與上唇和下唇遠(yuǎn)端的黃色外觀一致，參與類胡蘿卜素生物合成的基因在第II和IV–VII部分的表達(dá)水平高于其他部分（圖4c,；表S6）,。然而，花青素生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因,，特別是DFR和ANS的同源物,，優(yōu)先在第IV和VI部分表達(dá)（圖4c，e,，f,；表S6；數(shù)據(jù)集S5）,，它們幾乎完全是紅色,。

值得注意的是，NiorMYB113-1和NiorMYB1 13-2分別在第四部分（條紋）和第五部分（間隙2）中優(yōu)先表達(dá)（圖4c,，e,，f；表S6,；數(shù)據(jù)集S5）,。

Fig. 4

為了進(jìn)一步鑒定對東方豬籠草花瓣空間著色負(fù)責(zé)或不可或缺的基因，我們對七個部分表達(dá)水平變異系數(shù)高于-0.5的基因進(jìn)行了WGCNA,。共鑒定了20個共表達(dá)模塊（圖5a–b,，d；數(shù)據(jù)集S6）,，其中8個模塊（即M1,、M4、M8,、M9,、M12、M13、M15,、M18）僅與一個部分具有強(qiáng)相關(guān)性（Pearson相關(guān)系數(shù)[PCC]≥0.3）,，而其他模塊與多個部分具有較強(qiáng)相關(guān)性（圖5b–c）。

值得注意的是,，可能是因?yàn)樗鼈冊谄邆€部分的表達(dá)水平中的變異系數(shù)低于-0.5,，分別參與葉綠素生物合成、葉綠素降解和類胡蘿卜素生物合成的28,、6,、16個基因中的22、5,、15個沒有被納入WGCNA,。當(dāng)僅考慮與紅色區(qū)域相關(guān)的模塊時，在M9和第四部分（條紋）,、M12-M13和第五部分（間隙2）,、M15和第六部分（飛濺物）、M17和第四和第六部（條紋）之間觀察到強(qiáng)烈的相關(guān)性（圖5c）,。正如預(yù)期的,，上述NiorDFR和NiorANS基因分別包含在M17（條紋和Splatters）中，而NiorMYB113-1和NiorMYB113-2分別包含在M9（條紋）和M13（間隙2）中（圖5d,；數(shù)據(jù)集S6）,。與紅色區(qū)域形成相關(guān)的基因，如NiorDN16833（在M9中）,、NiorMYB12（在M13中）和NiorTT19（在M17中）也被鑒定出來（圖5e）,，盡管它們的確切作用仍不清楚。

Fig. 5

3.5 條紋和飛濺形成相關(guān)基因的功能分析

在已確定的候選基因中,，NiorMYB113-1和NiorMYB113-2引起了我們的特別關(guān)注,，因?yàn)樗鼈兪敲芮邢嚓P(guān)的重復(fù)基因（圖S1；數(shù)據(jù)集S7和S8）,，并且因?yàn)樗鼈冊谠S多其他物種中的對應(yīng)物通過調(diào)節(jié)花青素生物合成在顏色圖案的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。基于它們的時空表達(dá)模式，我們假設(shè)NiorMYB113-1和NiorMYB1 13-2分別通過促進(jìn)和抑制花青素生物合成來調(diào)節(jié)紅色的形成,。為了驗(yàn)證這一假設(shè),，我們使用VIGS技術(shù)降低了這兩個基因的表達(dá)（圖S2a–c），NiorANS用作陽性對照,。與模擬（圖6a1–a4）相比,，TRV2 NiorANS處理的具有強(qiáng)烈表型變化的植物的花瓣（表S3）不再具有紅色，而綠色和黃色在很大程度上保持不變（圖6b1–b4）,，這表明NiorANS確實(shí)是參與花青素生物合成途徑的關(guān)鍵基因,。

然而,，TRV2-NiorMYB113-1處理的具有強(qiáng)烈表型變化的植物的花瓣在條紋所在的區(qū)域只有少數(shù)紅細(xì)胞（圖6c1–c4，表S3）,。qRT-PCR表達(dá)分析證實(shí),，NiorMYB113-1在具有強(qiáng)烈表型變化的花瓣中顯著下調(diào)，如NiorCHS1,、NiorF3H,、NiorF3’H、Nior DFR和NiorANS的情況（圖S2d）,。這些結(jié)果表明NiorMYB113-1促進(jìn)花青素的合成,，從而促進(jìn)紅色的形成。

值得注意的是,，當(dāng)NiorMYB113-2被擊倒時,，具有強(qiáng)烈表型變化的花瓣缺少條紋和飛濺物之間的間隙（即間隙2；圖6d1–d4）,。同時,，雖然在具有強(qiáng)烈表型變化的花瓣中檢測到NiorMYB11-2的非常低的表達(dá),，但NiorF3H,、NiorF3'H、Nior DFR和NiorANS顯著上調(diào)（圖S2e,，表S3）,，這表明NiorMYB1 13-2確實(shí)是花青素生物合成的阻遏物，至少在間隙2中,。當(dāng)追蹤更大的“Splatters”區(qū)域的形成時,，我們發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞連續(xù)出現(xiàn)并呈肢端狀（圖S3a1–a6），這表明條紋和Splatters實(shí)際上是由NiorMYB113-2活性分隔的更大斑塊的兩部分,。同時,，可能是由于NiorMYB113-2的負(fù)面影響，紅細(xì)胞的數(shù)量,、顏色和分布面積分別增加,、加深和擴(kuò)大（至邊緣、葉肉,，甚至是背面表皮）（圖6d4）,，這表明NiorMYB1 13-2也對花瓣的至少一些其他部分的紅細(xì)胞形成產(chǎn)生負(fù)面影響。

有趣的是,，TRV2-NiorMYB113-2處理的具有中等表型變化的植物的花瓣（表S3）部分扭曲,、消失和/或以其他方式合并條紋和飛濺（圖S3b1–b6）。與表型變化一致,，NiorMYB113-2在花瓣中的表達(dá)水平也顯著或適度降低（圖S3c）,，這表明NiorMYB1 13-2也決定了間隙的位置和方向,，后者的功能是劑量依賴性的。

Fig. 6

04

結(jié)論

觀察到不同表皮細(xì)胞的著色是一個高度動態(tài),、非同步的過程,，進(jìn)一步表明東方黑種草花瓣在顏色模式上的復(fù)雜程度可能比我們實(shí)際測量的還要高。我們的研究不僅闡明了復(fù)雜顏色圖案形成過程中的時空變化,，還揭示了高度專業(yè)化水平條紋產(chǎn)生的機(jī)制,。

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