02

技術(shù)路線

Plant transformation\AsTIR19 OE lines and FOC bioassays 

RNA extraction and sequencing

In silico expression profiling

Functional analysis of DEGs

Phylogenetic analysis、Subcellular localization 

Transient overexpression

Expression analysis by qRT-PCR

03

主要結(jié)果

3.1 擬南芥AsTIR19 OE系對FOC感染的抗性增強(qiáng)

為了評估AsTIR19過表達(dá)對FOC感染的影響,，我們產(chǎn)生了五個(gè)擬南芥過表達(dá)（OE）系,，命名為AsTIR19-OE系（OE1.4、OE2.6,、OE6.4,、OE8.2和OE-11.1）。通過PCR對標(biāo)記基因BAR（草丁膦N-乙?；D(zhuǎn)移酶）進(jìn)行轉(zhuǎn)化確認(rèn),。通過qRT-PCR確認(rèn)了T2代這些品系中AsTIR19轉(zhuǎn)基因的過表達(dá),，揭示了品系之間轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的輕微變化。在野生型（WT）植物中未檢測到AsTIR19的表達(dá),。重要的是,，與野生型植物相比，OE品系在營養(yǎng)或生殖性狀上都沒有表現(xiàn)出明顯的差異,，這表明不同水平的AsTIR19過表達(dá)不會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的可見表型變化,。

對于FOC生物測定分析，根據(jù)Diener和Ausubel（2005）提出的量表,，在接種的擬南芥OE系和WT植物中評估了疾病癥狀,。野生型植物在7 DAI時(shí)出現(xiàn)了最初的枯萎病癥狀，其特征是老葉變黃（圖1A）,。在這個(gè)階段,，除了OE-2.6系表現(xiàn)出輕微癥狀外，其他四個(gè)OE系都沒有出現(xiàn)癥狀,。到第14次DAI時(shí),，大多數(shù)野生型植物都出現(xiàn)了典型的FOC癥狀，如葉片黃化,、進(jìn)展為壞死病變和植物死亡（圖1A）,。相比之下，所有OE品系的疾病進(jìn)展明顯較慢,，OE-6.4和OE-11.1沒有顯示出疾病跡象,，OE-1.4和OE-8.2在老葉上顯示出非常輕微的癥狀或黃化（圖1A）。

在7和14 DAI時(shí)對FOC疾病進(jìn)展進(jìn)行評估,。與野生型相比,，所有五個(gè)AsTIR19 OE品系的疾病指數(shù)得分均顯示出顯著差異（p<0.05），0（零）代表最低（死亡植物）,，5（五）代表最高（無明顯癥狀）得分（圖1C）,。在7 DAI時(shí)，與野生型植物相比,，所有OE系都表現(xiàn)出更高的疾病指數(shù)得分,，增加了1.6倍。到14 DAI時(shí),，OE品系和WT植物之間的差異變得更加明顯,，最大增加了4倍（圖1B）。值得注意的是,，OE-11.1和OE-6.4顯示了最高的疾病指數(shù)（圖1C）,。在這里，我們發(fā)現(xiàn)AsTIR19過表達(dá)導(dǎo)致所有測試的擬南芥OE系中FOC感染的顯著減少，這可以通過疾病指數(shù)的降低和黃化和葉片發(fā)育遲緩等疾病癥狀的出現(xiàn)延遲來證明,。

為了進(jìn)一步研究AsTIR19過表達(dá)導(dǎo)致FOC抗性增加的轉(zhuǎn)錄變化,，我們對AsTIR19OE-11.1（OE-11）品系和野生型植物的整體轉(zhuǎn)錄行為進(jìn)行了全面分析。此外,，我們還探討了病原體挑戰(zhàn)對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因野生型植物的影響。選擇OE-11系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析是因?yàn)槠湓?和14 DAI時(shí)的疾病指數(shù)很高,，在整個(gè)生物測定過程中顯示出健康的表型,，沒有任何疾病跡象。

圖1,。四個(gè)接種AsTIR19 OE品系和野生型（WT）植物的FOC疾病癥狀和指數(shù)評分,。

（A） AsTIR19 OE品系和WT植物在FOC接種（DAI）后0、7和14天表現(xiàn)出的癥狀

（B）FOC疾病進(jìn)展期間AsTIR19OE品系列和WT植物的疾病指數(shù)評分,。

（C） AsTIR19 OE品系和WT在14 DAI時(shí)的疾病指數(shù)評分（p<0.05）,；

3.2 OE-11品系和野生型植物的轉(zhuǎn)錄組測序

為了闡明AsTIR19調(diào)節(jié)擬南芥對FOC抗性的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了一項(xiàng)全面的分析,，比較了AsTIR119過表達(dá)系（OE-11）和野生型根及其未接種對照的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組,。通過比較這些條件，我們旨在鑒定參與AsTIR19在應(yīng)對病原體挑戰(zhàn)時(shí)增強(qiáng)抗性的差異表達(dá)基因和調(diào)控途徑,?？傮w而言，12個(gè)cDNA文庫,，包括每種條件的三個(gè)生物重復(fù),，產(chǎn)生了152872554 Mb的HiSeq-4000原始讀數(shù)，其中平均96.3%的總讀數(shù)成功地映射到擬南芥參考基因組（第10版）,。來自12個(gè)cDNA文庫的RNASeq數(shù)據(jù)的PCA（主成分分析）分析表明,，根據(jù)每個(gè)基因的計(jì)數(shù)，接種FOC的樣品（紅色和綠色）聚集在一起,，與未接種的樣品（藍(lán)色和紫色）明顯分離,，而不管轉(zhuǎn)基因插入如何，這表明OE-11品系和野生型植物中存在核心感染反應(yīng),。盡管如此,，轉(zhuǎn)基因和野生型樣本都聚集在亞群中，這表明除了核心感染反應(yīng)基因外,，轉(zhuǎn)基因植物中還調(diào)節(jié)了特定的FOC反應(yīng)基因,。

3.3 AsTIR19過表達(dá)和FOC接種引起的轉(zhuǎn)錄組譜變化

接種和未接種FOC的OE-11系和野生型植物之間DEGs的總體轉(zhuǎn)錄譜如圖2A中的火山圖所示。在所有比較中,，上調(diào)的DEG數(shù)量（紅色）超過了下調(diào)的數(shù)量（藍(lán)色）,，與未接種的植物相比，接種FOC的OE-11系中鑒定的DEG（OE-11-I vs OE-11-NI）顯示出最高的表達(dá)量（圖2A）,。在未接種的OE-11和野生型植物（OE-11-NI vs WT-NI）之間觀察到最多的DEG（778）,，包括455個(gè)受轉(zhuǎn)基因表達(dá)影響的上調(diào)基因和323個(gè)下調(diào)基因（圖2B）,。這相當(dāng)于整個(gè)擬南芥基因組的約2.88%(https://www./).

與未接種的對照植物相比，F(xiàn)OC接種顯著改變了OE-11系（316個(gè)上調(diào)和118個(gè)下調(diào)）和WT植物（324個(gè)上調(diào)和304個(gè)下調(diào)）中許多DEG的表達(dá),，其中179個(gè)DEG僅在接種的轉(zhuǎn)基因系中發(fā)現(xiàn)（圖2B）,。

圖2C顯示了在所研究的四種條件下鑒定的DEGs的總體轉(zhuǎn)錄譜。我們發(fā)現(xiàn),，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)引起的大多數(shù)DEGs（OE-11-NI vs WT-NI）（a）在轉(zhuǎn)基因植物中表現(xiàn)出與FOC接種引起的DEGs相反的表達(dá)行為（OE-11-I vs OE-11-NI）（d）,。這種整體對比的表達(dá)行為表明，在擬南芥中,，由于AsTIR19過表達(dá)而調(diào)節(jié)的大多數(shù)DEGs與FOC接種引起的DEGs不同（圖2B,、C），與野生型植物相比,，轉(zhuǎn)基因OE植物中的不同基因和代謝途徑是對病原體的反應(yīng),。

我們沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)的基因組區(qū)域或基因簇（FDR?<?0.000001) 在本研究中應(yīng)用的四種條件中，有證據(jù)表明,，重要基因在五條擬南芥染色體上均勻分布（圖3）,。

圖2:在FOC接種（I）和非接種（NI）條件下，AsTIR19 OE-11品系和WT植株中的差異表達(dá)基因（DEGs）,。

（A） 差異基因表達(dá)的火山圖分析,，以t檢驗(yàn)的?log10（P值）為y軸，log2（倍數(shù)變化）為x軸,。紅點(diǎn)表示上調(diào)的DEG,，藍(lán)點(diǎn)表示下調(diào)的DEG。

（B） 維恩圖顯示了四個(gè)比較中的DEGs交點(diǎn),；

（C） 轉(zhuǎn)基因擬南芥與接種和未接種FOC的野生型植物中DEGs的層次聚類分布熱圖,。

3.3 FOC感染下OE-11系防御標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

與未接種植物相比，通過PlantTFDB和GO鑒定的TF在接種FOC的OE-11系中富集（OE-11-I與OE-11-NI）,，用于在生物脅迫下構(gòu)建蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),。從物理相互作用、共表達(dá),、遺傳相互作用和共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的角度探索了蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系,。

GeneMANIA分析生物脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄因子，分為兩個(gè)主要網(wǎng)絡(luò)：（A）上調(diào)的DEGs和（B）下調(diào)的DEGs,。節(jié)點(diǎn)根據(jù)其功能著色,，如圖例所示。從物理相互作用,、共表達(dá),、預(yù)測功能、共定位、共同途徑,、遺傳相互作用和共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域等方面探討了蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系,。

總體而言，與未接種的植物相比,，接種FOC的OE-11系中這些防御標(biāo)記的表達(dá)顯著增加,，表明轉(zhuǎn)基因過表達(dá)的影響被病原體線索放大了（圖）。在所有研究的15個(gè)標(biāo)記物的計(jì)算機(jī)模擬中也觀察到了這種上調(diào)的表達(dá)趨勢（RNASeq數(shù)據(jù)）,，證實(shí)了我們的結(jié)果的可重復(fù)性,，并表明在轉(zhuǎn)基因植物中觀察到的增強(qiáng)防御反應(yīng)期間激活了復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)。

接種FOC的OE-11品系和未接種植物的qRT-PCR表達(dá)分析,。相對于野生型未接種植物（藍(lán)色）,，計(jì)算了FOC接種OE-11系（橙色）中擬南芥標(biāo)記基因在植物激素和防御途徑中的mRNA水平的相對定量,。

圖表突出了調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)的途徑之間的關(guān)鍵相互作用,。它說明了在接種FOC的OE-11系中，通過qRT-PCR確定的表達(dá)上調(diào)的各種標(biāo)記基因之間的聯(lián)系,，以及各自的激素信號通路,。JA-ET和SA信號通路似乎構(gòu)成了轉(zhuǎn)基因系中植物免疫系統(tǒng)反應(yīng)的支柱，而ET通路的基因似乎也起著調(diào)節(jié)作用,。

Python代碼衍生圖顯示了接種FOC的OE-11系中防御激素途徑（SA,、JA、ET）及其相關(guān)基因的上調(diào),。藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示激素途徑,，綠色節(jié)點(diǎn)表示與每個(gè)途徑相關(guān)的基因，灰色箭頭表示基因與其各自途徑之間的連接,。其他交互以紅色突出顯示,。

04

結(jié)論

這些發(fā)現(xiàn)表明，通過在不同的宿主植物中過表達(dá)NLR基因,，可以實(shí)現(xiàn)對植物病原真菌的更廣泛抗性,。因此，AsTRI19基因具有在一系列易感作物中探索的潛力,，植物育種計(jì)劃可以通過開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記來獲利,，從而能夠精確選擇這種轉(zhuǎn)基因并將其滲入優(yōu)良品種。

此外,，AsTIR19與其他抗性基因的聚合提供了一種強(qiáng)有力的策略來管理病原體的變異性,，并降低抗性隨時(shí)間推移而崩潰的可能性。這種多基因方法可以確保對各種尖孢鐮刀菌菌株的持續(xù)保護(hù),，有助于培育更具彈性的作物品種,，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。