編譯：王艷林,，編輯：謝衣,、江舜堯。

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本實(shí)驗(yàn)選用的嫁接山核桃植株是由兩年生砧木和一年生接穗嫁接得到。嫁接一年后,，在2018年8月至10月將植株移植到浙江農(nóng)林大學(xué)（N 30°23′, E 119°72′）溫室中,，并移栽到含有珍珠巖，蚯蚓糞,，和土壤（1:3:4）的盆中,，溫室內(nèi)溫度為25-35℃，濕度為70％,，光照時(shí)間為12 h,。在實(shí)驗(yàn)開始之前，每三天澆一次幼苗,，持續(xù)15天,。

為了選擇合適的褪黑素濃度，通過用葉面噴霧處理植物研究了五種不同濃度（0,、25,、50、100和200 μM）的作用,。在100 μM褪黑素處理下植株光合性能最優(yōu)異,，因此選擇100 μM的濃度。試驗(yàn)初期將嫁接山核桃植株分為兩組,，一組噴蒸餾水,，一組噴100 μM褪黑素，每天處理5次,。在最后一褪黑素處理的第二天,，將植株用含有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的PEG-6000處理,。實(shí)驗(yàn)設(shè)置分為8組（表1），在PEG處理后（DAT）0,、10和40天進(jìn)行采樣,。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

用1 mL的80％丙酮?jiǎng)驖{1 g新鮮葉子,，然后在1500g（4℃）離心20分鐘,。在645和663 nm處記錄上清液的吸光度來定量葉綠素含量。使用相同的方法處理葉片,，在480和510 nm處記錄上清液的吸光度來定量總類胡蘿卜素含量,。

使用80%乙醇提取葉片中淀粉，然后使用稀釋的高氯酸再溶解,。將新鮮制備的蒽酮試劑（10 mL）與稀釋溶液（5 mL）一起添加到樣品管中,。將各管充分混合，加熱至100℃,，然后立即冷卻至25℃,，最后在620 nm下確定顏色強(qiáng)度。

使用Li-6400便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)（LICOR,，林肯,，內(nèi)布拉斯加州，美國(guó)）測(cè)定光和氣體參數(shù),。包括凈光合速率（P_n）,，蒸騰速率（E_t）和氣孔導(dǎo)度（G_s）。測(cè)定是在11:00至14:00的陽光下進(jìn)行的,。

使用便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒庥?jì)（pam-2500）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù),，PSII的最大光合作用效率（F_v/F_m）和PSII的電子傳輸速率（ETR）。在陽光充足的情況下從11:00到14:00進(jìn)行測(cè)定,。

采用硫代巴比妥酸法測(cè)定葉片中的丙二醛含量。將新鮮葉片（1 g）在0.1％三氯乙酸（TCA）（5 mL）中磨碎,，并在4℃下離心（15 min,，10000 g）。然后將4 mL含有0.5％硫代巴比妥酸的20％TCA加入到1 mL的上清液中,。將反應(yīng)混合物在95℃下孵育30分鐘,，然后在冰上冷卻。最后,，將樣品在4℃（15 min,，10000 g）下離心，并在532和600 nm下檢測(cè)吸光度,。

用蒽比色法測(cè)定總可溶性糖含量,。將新鮮葉片（1 g）加入到15 mL的煮沸蒸餾水,，并在30 min后將體積補(bǔ)充至100 mL。將1 mL的煮沸溶液與蒽酮試劑（5 mL）混合,，再煮沸10 min,。將樣品冷卻至室溫，并在620 nm處檢測(cè)吸光度,。

采用茚三酮方法測(cè)定葉片中脯氨酸含量。將0.5 g新鮮葉片在3％磺基水楊酸水溶液（10 mL）中研磨充分,。將過濾后的勻漿（2 mL）與酸茚三酮（2 mL）和冰醋酸（2 mL）在試管中于100℃反應(yīng)1 h,。用冰浴終止反應(yīng)，將樣品儲(chǔ)存在4℃直至進(jìn)一步使用,。將反應(yīng)混合物與4 mL甲苯劇烈混合,，并在520 nm下測(cè)定吸光度（使用甲苯作為空白）。

充分研磨的新鮮葉片的上清液用于測(cè)定抗氧化酶活性,。按照超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒中的說明書（＃A001-2,，江蘇省南京市建城生物工程研究所）來測(cè)定SOD活性。按照過氧化物酶（POD）測(cè)定試劑盒（A084-3,，南京建城生物工程學(xué)院,，中國(guó)）的說明書和在420 nm處的吸光度測(cè)定POD活性?？箟难徇^氧化物酶（APX）活性按照APX測(cè)定試劑盒（A123,，南京建城生物工程研究所，南京）說明書測(cè)定,。將15 μL葉片提取物添加到磷酸鹽緩沖液（1 mL,，50 mM，pH 7.0）和過氧化氫（2.5 μL,，30%）的混合物中,，然后在240 nm處測(cè)定吸光度以確定氧化氫酶（CAT）活性。

將20 mg植物樣品與50％預(yù)冷的甲醇（120 μL）混合,，渦旋1分鐘,，然后在25℃下溫育10 min。將混合物在-20℃下過夜,，然后在4000 g下離心20 min,。將上清液轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的試管中，并保存在-80℃下,，直到進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜分析（LC-MS）,。代謝物通過高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀執(zhí)行正向和負(fù)向模式（TripleTOF5600plus，SCIEX,，英國(guó)）進(jìn)行檢測(cè),。飛行時(shí)間（TOF）范圍是60–1200 Da,。為了評(píng)估整個(gè)分析過程中的LC-MS穩(wěn)定性，在10個(gè)樣品后獲得了質(zhì)控（QC）樣品,。QC樣品低于50％或生物學(xué)樣品低于80％的檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物被排除在外,。

使用新鮮葉片提取1 μg總RNA，然后使用PrimeScript RT Master Mix（Takara）合成cDNA,。使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）在RT-PCR系統(tǒng)C1000 Touch Thermal Cycler（Bio-Rad）中評(píng)估基因表達(dá),。引物序列在補(bǔ)充表1中提供，且反應(yīng)條件為在95℃變性10 s,，在57℃退火10 s和在72℃延伸20 s,，共45個(gè)循環(huán)。使用肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部對(duì)照基因,，表達(dá)量以2^-ΔΔCt計(jì)算,。

使用單向方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，然后進(jìn)行鄧肯檢驗(yàn)（P <0.05）,。統(tǒng)計(jì)差異用小寫字母表示,，使用MS-Excel 2010和TBtools軟件繪制圖表。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,。

1 褪黑素恢復(fù)了干旱脅迫下植株色素，淀粉含量和整體表型

干旱脅迫導(dǎo)致色素（圖1A,，B）和淀粉含量（圖1C）急劇下降,，并造成植物生長(zhǎng)的總體延緩，這表現(xiàn)在表型上（補(bǔ)充圖1）,。在最強(qiáng)干旱脅迫下,，與對(duì)照（40 DAT）相比，葉綠素,，類胡蘿卜素和淀粉含量分別下降了73.8％,，75.2％和71.3％。然而,，用褪黑素預(yù)處理可顯著恢復(fù)葉綠素（圖1A）,，類胡蘿卜素（圖1B）和淀粉（圖1C）的含量,，分別為236.2％,，257.5％和320.1％,。葉綠素酶（CHLASE）,，脫鎂葉綠素酶（PPH）和脫鎂葉綠酸-α-加氧酶（PAO）的酶促作用促進(jìn)了葉綠素的降解,，并且在干旱脅迫下，編碼這些酶的基因的轉(zhuǎn)錄水平也被上調(diào),。在當(dāng)前研究中,，褪黑素處理導(dǎo)致葉綠素含量的恢復(fù),，表明減少了葉綠素的降解,。這可能是由于褪黑素介導(dǎo)的CHLASE，PPH和PAO在干旱脅迫下的下調(diào),。本研究結(jié)果還表明,，在干旱脅迫下，CHLASE表達(dá)上調(diào),，大多數(shù)葉綠素代謝產(chǎn)物下調(diào),。然而,，在褪黑素預(yù)處理的植物中,，CHLASE表達(dá)下調(diào)，葉綠素代謝物上調(diào),。這可以解釋葉綠素的恢復(fù),。在本研究（褪黑激素處理后）中觀察到的類胡蘿卜素含量恢復(fù)是由于褪黑素介導(dǎo)的類胡蘿卜素生物合成調(diào)控。這在我們的代謝組學(xué)分析中得到了支持,，在該分析中,，我們觀察到在干旱脅迫下類胡蘿卜素生物合成途徑的大多數(shù)代謝產(chǎn)物均被下調(diào)，但是褪黑激素處理導(dǎo)致了代謝產(chǎn)物的上調(diào),。干旱脅迫下淀粉含量的降低可能是由于淀粉降解加劇,。此外，淀粉的產(chǎn)生與光合作用直接相關(guān),，干旱脅迫下植物的光合作用下降（由于葉綠素和RuBisCo功能下降）,。干旱脅迫下根部對(duì)蔗糖的需求增加，進(jìn)而將過量的蔗糖推向根部,，導(dǎo)致葉片中的蔗糖水平降低,。褪黑素正調(diào)控與光合作用，碳水化合物積累和蔗糖韌皮部負(fù)載有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄水平,。 

圖1.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株總?cè)~綠素（A）類胡蘿卜素（B）和淀粉（C）含量的影響,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，具有相同字母的均值在P ≤ 0.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異,。CN,，對(duì)照組；P1,，5％聚乙二醇（PEG）,；P2,，10％PEG；P3,，30％PEG,；M，100 μM褪黑素,；MP1,，M + P1；MP2,，M + P2,；MP3，M + P3,。0d,，10d和40d分別表示PEG處理后的0、10和40天,。

補(bǔ)充圖1.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株表型的影響,。 PEG處理40天后，葉片（A）和整株植物（B）,。CN,，對(duì)照組；P1,，5％聚乙二醇（PEG）,；P2，10％PEG,；P3,，30％PEG；M,，褪黑激素100 μM,；MP1，M + P1,；MP2,，M + P2；MP3,，M + P3,。

2 褪黑素改善了干旱條件下植株的氣體交換參數(shù)和光系統(tǒng)II效率

干旱脅迫下植株光和氣體參數(shù)P_n，G_s和E_t逐漸下降,。與對(duì)照植株相反,，在40 DAT的嚴(yán)重干旱脅迫導(dǎo)致P_n，G_s和E_t分別急劇下降了72.1％，75.5％和68.9％,。褪黑素預(yù)處理的植株表現(xiàn)出較少的干旱的負(fù)面影響,，P_n（圖2A），G_s（圖2B）和E_t（圖2C）分別提高了107.5％,，99.7％和81.3％,。干旱脅迫對(duì)F_v/F_m和ETR產(chǎn)生負(fù)面影響。與對(duì)照相比,，嚴(yán)重干旱脅迫植株（40 DAT）的F_v/F_m和ETR顯著降低,。然而，褪黑素預(yù)處理通過增強(qiáng)F_v/F_m（圖3A）和ETR（圖3B）顯著改善了PSII的功能,。

褪黑素介導(dǎo)的光合作用恢復(fù)是由于干旱脅迫下植物的葉綠素分子和光合機(jī)構(gòu)受到保護(hù),。褪黑素處理過的植株葉面積的增加也有利于缺水條件下的光合作用過程。我們還觀察到褪黑素預(yù)處理植物的葉面積有所改善,。褪黑素可保護(hù)葉綠體超微結(jié)構(gòu)免受干旱產(chǎn)生的氧化脅迫,，從而提高干旱脅迫下植物的光合作用效率。褪黑素有助于維持葉肉細(xì)胞的細(xì)胞膨脹和水分平衡,，從而增強(qiáng)氣孔導(dǎo)度,，并保護(hù)或幫助恢復(fù)柵欄和海綿組織，以提高光合機(jī)構(gòu)的功能,。褪黑素還通過調(diào)節(jié)RUBISCO（核酮糖二磷酸羧化酶）,，FBA（果糖雙磷酸醛縮酶）,，FBP（果糖-1, 6-二磷酸酶）,，SEBP（景天庚酮糖-1,7-雙磷酸酶）和RPI（5-磷酸核糖異構(gòu)酶）的表達(dá)來調(diào)節(jié)關(guān)鍵的光合作用過程，例如碳固定途徑,。在本研究中,，褪黑素處理上調(diào)了碳固定和碳代謝途徑的代謝產(chǎn)物，支持了干旱脅迫植株光合作用效率的整體恢復(fù),。 

圖2.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株光合氣體交換參數(shù)的影響,。光合速率，P_n（A）,；氣孔導(dǎo)度,，G_s（B）；蒸騰速率,，E_t（C）,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，具有相同字母的均值在P ≤ 0.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異,。CN,，對(duì)照組；P1，5％聚乙二醇（PEG）,；P2,，10％PEG；P3,，30％PEG,；M，100 μM褪黑素,；MP1,，M + P1；MP2,，M + P2,；MP3，M + P3,。0d,，10d和40d分別表示PEG處理后的0、10和40天,。

圖3.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株光系統(tǒng)II最大量子效率（A）和電子傳輸速率（B）的影響,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，具有相同字母的均值在P ≤ 0.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異,。CN,，對(duì)照組；P1,，5％聚乙二醇（PEG）,；P2，10％PEG,；P3,，30％PEG；M,，100 μM褪黑素,；MP1，M + P1,；MP2,，M + P2；MP3,，M + P3,。0d，10d和40d分別表示PEG處理后的0,、10和40天,。

3 褪黑素減少了干旱條件下植株的脂質(zhì)過氧化作用并增加了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累

干旱脅迫對(duì)山核桃植株造成了氧化脅迫，其突出之處是隨著干旱水平的增加，MDA積累增加,。在嚴(yán)重干旱脅迫（40 DAT）下,，我們觀察到MDA積累比對(duì)照植株多127.3％。但是,，褪黑素預(yù)處理可顯著降低MDA含量,，并有助于減少干旱引起的氧化脅迫（圖4A）。在干旱條件下,，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量（總可溶性糖和脯氨酸）增加,，褪黑素處理過的植株遭受干旱脅迫時(shí)，其積累也增加,。與未經(jīng)褪黑素處理的植株相比,，經(jīng)褪黑素預(yù)處理的植株在嚴(yán)重干旱下的總可溶性糖含量增加了64.4％（40 DAT）（圖4B）。另外,，與僅中度脅迫的植株相比,，在用褪黑素預(yù)處理的植株中，脯氨酸的積累在10 DAT達(dá)到峰值（194.3％）,，并在中度干旱脅迫（P2）下生長(zhǎng)（圖4C）,。

褪黑素通過增強(qiáng)有害ROS的清除來保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷。褪黑激素也觸發(fā)了過氧化氫,，羥基自由基和其他有害醛的清除,。這些過程可保護(hù)脂質(zhì)膜免于過氧化，并保護(hù)細(xì)胞壁免于干旱脅迫損傷,。褪黑素還可以通過觸發(fā)抗氧化酶的活性來增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)的性能,，從而保持ROS的產(chǎn)生和積累之間的平衡。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑控制其他相容性溶質(zhì)的積累,，例如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（即總可溶性糖和脯氨酸）,，褪黑素觸發(fā)這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在遭受干旱脅迫的植物中的生物合成,。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)生物合成的增強(qiáng)伴隨著其積累的增加,，這有助于干旱脅迫植物的滲透調(diào)節(jié)。在本研究中,，代謝組學(xué)表明,，干旱脅迫和褪黑素處理可提高糖代謝的代謝產(chǎn)物，從而在缺水條件下支持褪黑素介導(dǎo)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié),。 

圖4.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株MDA（A）總可溶性糖（B）和脯氨酸（C）含量的影響,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，具有相同字母的均值在P ≤ 0.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異,。CN,，對(duì)照組；P1，5％聚乙二醇（PEG）,；P2,，10％PEG；P3,，30％PEG,；M，100 μM褪黑素,；MP1,，M + P1；MP2,，M + P2,；MP3，M + P3,。0d,，10d和40d分別表示PEG處理后的0、10和40天,。

4 褪黑素刺激干旱脅迫下植株的抗氧化酶

在干旱脅迫下的植株以及褪黑素處理過的植株在干旱脅迫下生長(zhǎng)時(shí),，抗氧化酶（SOD，CAT,，POD和APX）的活性增加（圖5）,。與對(duì)照相比，中度脅迫植株（P3,，10 DAT）中的SOD活性提高了98.3％,。與干旱脅迫的植株相比，褪黑素+干旱處理的植株（MP3）中該酶的活性進(jìn)一步提高（28.1％）（圖5A）,。與嚴(yán)重脅迫的植株（40 DAT）相比,，褪黑素處理過的植株在嚴(yán)重干旱脅迫下也顯示出較高的酶活性-CAT為26.1％（圖5B），POD為21.42％（圖5C）,，而APX為8.9％（圖5D）,。褪黑素調(diào)節(jié)干旱脅迫植物的酶促抗氧化防御系統(tǒng)。這是對(duì)干旱誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的響應(yīng),，以維持植物細(xì)胞中的ROS平衡,。褪黑素介導(dǎo)的抗氧化酶的調(diào)節(jié)歸因于編碼這些酶的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。我們還發(fā)現(xiàn)褪黑素上調(diào)了酶（SOD,，CAT,，POD,，APX）的基因表達(dá),，這可能是褪黑素調(diào)節(jié)酶活性的潛在機(jī)制的證據(jù)。 

圖5.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株抗氧化酶活性的影響,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD，具有相同字母的均值在P ≤ 0.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異,。CN,，對(duì)照組；P1,，5％聚乙二醇（PEG）,；P2，10％PEG,；P3,，30％PEG；M,，100 μM褪黑素,；MP1，M + P1,；MP2,，M + P2；MP3,，M + P3,。0d，10d和40d分別表示PEG處理后的0,、10和40天,。

5 褪黑素調(diào)節(jié)干旱條件下植株的代謝組學(xué)響應(yīng)

為了進(jìn)一步了解干旱脅迫下山核桃的反應(yīng)，我們進(jìn)行了代謝研究,。通常,，嚴(yán)重的干旱脅迫下調(diào)了代謝產(chǎn)物，而褪黑激素處理導(dǎo)致代謝產(chǎn)物上調(diào)（圖6）,。在嚴(yán)重干旱脅迫下的植株中（與對(duì)照植株相比）,，1661種代謝產(chǎn)物被上調(diào)，而2298種代謝產(chǎn)物被下調(diào)（圖7A）,。然而,，當(dāng)比較MP3（褪黑素預(yù)處理在嚴(yán)重干旱脅迫下生長(zhǎng)）和P3（嚴(yán)重脅迫）植物時(shí)，我們觀察到1203上調(diào)的代謝產(chǎn)物和僅271下調(diào)的代謝產(chǎn)物（圖7A）,。

將P3組與對(duì)照植株進(jìn)行比較時(shí),，大多數(shù)ABC（ATP結(jié)合盒）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝產(chǎn)物均被下調(diào)。但是,，當(dāng)MP3和P3組相比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)褪黑激素處理后大多數(shù)代謝產(chǎn)物均被上調(diào)（圖7B）,。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用ATP衍生的能量,，我們觀察到干旱脅迫下光合作用期間電子傳遞速率降低,。這可以解釋ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)代謝產(chǎn)物的下調(diào)。此外,，褪黑素在脅迫條件下上調(diào)了植株中與ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因,。

在P3組植株中，我們觀察到卟啉和葉綠素代謝的大多數(shù)代謝產(chǎn)物均被下調(diào)（與未處理的對(duì)照植物相比）,。在MP3組中存在相反的模式——與嚴(yán)重干旱脅迫的植株相比,，代謝產(chǎn)物被上調(diào)（圖7C）。在嚴(yán)重干旱條件下,，類胡蘿卜素途徑的代謝產(chǎn)物也被下調(diào),。與未經(jīng)干旱處理的植株相比，在經(jīng)過干旱處理的褪黑素處理過的植株中,，類胡蘿卜素生物合成途徑的代謝產(chǎn)物被上調(diào)（圖7D）,。該結(jié)果可歸因于褪黑素介導(dǎo)的葉綠素代謝相關(guān)基因（CHLASE，PPH,，PAO和葉綠素降解過氧化物酶,；Chl-PRX）的下調(diào)。褪黑素還通過上調(diào)類胡蘿卜素生物合成途徑中的基因PSY1（八氫番茄紅素合酶1）和CRTISO（類胡蘿卜素異構(gòu)酶）來調(diào)節(jié)干旱條件下類胡蘿卜素的生物合成,。在脅迫條件下,，褪黑激素刺激了類胡蘿卜素的生物合成，從而增強(qiáng)了植物的抗性,。

當(dāng)將P3組與對(duì)照組相比時(shí),，碳固定和代謝的最多代謝物被下調(diào)，而當(dāng)將MP3植物與干旱脅迫的植物相比較時(shí),，相同的代謝物被上調(diào)（圖7E）,。在兩組比較中，即將P3與對(duì)照組（未處理）比較,，將MP3與P3組比較,，糖代謝的代謝物大部分被上調(diào)。這表明在干旱條件下并用褪黑激素處理可刺激糖代謝（圖7F）,。褪黑素通過調(diào)節(jié)編碼功能性酶,，如RUBISCO，FBA,，FBP,，SEBP和RPI的關(guān)鍵基因的表達(dá)在分子水平上調(diào)節(jié)碳固定途徑。這可以解釋褪黑激素對(duì)碳和代謝途徑的調(diào)節(jié),。

干旱脅迫和褪黑素處理也上調(diào)了苯丙烷途徑的代謝產(chǎn)物,。當(dāng)將P3組與對(duì)照（未處理）進(jìn)行比較時(shí)，最多代謝物被上調(diào)（113）,，而當(dāng)將MP3植株與P3進(jìn)行比較時(shí),，則43種代謝物被上調(diào)（圖7G）,。苯丙烷途徑是關(guān)鍵的次級(jí)代謝途徑，在植物對(duì)非生物脅迫的抗性中發(fā)揮重要作用,，在植物中有助于抗旱的酚類化合物包括類黃酮,，黃酮和酚酸。褪黑素已顯示出上調(diào)花色苷生物合成途徑中涉及的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（例如MYB,，bHLH和WD40）,，通過乙烯細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)多酚生物合成，并上調(diào)苯丙氨酸解氨酶（PAL）的表達(dá),，這是苯丙氨酸途徑的關(guān)鍵酶,。我們還發(fā)現(xiàn)在兩種條件下，即干旱和褪黑激素+干旱,，PAL表達(dá)上調(diào),。 

圖6.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株總代謝的影響。P3與CK的比較（A,，C）和MP3與P3的比較（B,，D）。正比例表示代謝產(chǎn)物的上調(diào),，而負(fù)比例表示代謝產(chǎn)物的下調(diào),。（CK，對(duì)照組,；P3,，30％聚乙二醇；MP3,，100 μM褪黑素+ P3）,。（PEG處理后40天）。

 圖7.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株代謝組學(xué)響應(yīng)的影響,。數(shù)據(jù)顯示P3與CK（A）和MP3與P3（B）的比較,。（PEG處理后40天）。（CK,，對(duì)照組,；P3，30％聚乙二醇,；MP3,，100 μM褪黑素+ P3）。

6 褪黑激素及其與植物激素的串?dāng)_賦予抗旱性

褪黑素調(diào)節(jié)關(guān)鍵植物激素的水平,，例如細(xì)胞分裂素（CKs）,，赤霉素（GA），油菜素類固醇（BRs）,，茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）（圖8A）,。干旱脅迫對(duì)玉米素（ZT）具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,，而褪黑激素對(duì)ZT具有正調(diào)節(jié)作用（圖8B）,。干旱和褪黑素正調(diào)控赤霉素A14（GA14）,，24-表油菜素內(nèi)酯（24-EBL）和茉莉酸（JA）（圖8B）。干旱也對(duì)ABA產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用,，而褪黑激素對(duì)ABA則具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用,。此外，與干旱處理（P3）相比,，ABA在MP3組被負(fù)調(diào)控（圖8B）,。褪黑素通過上調(diào)CK信號(hào)關(guān)鍵成員的基因表達(dá)來誘導(dǎo)CK的生物合成，這些關(guān)鍵成員包括應(yīng)答調(diào)節(jié)劑（A型RR,，B型RR）,，組氨酸激酶（HKs）和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPs），最終改善了植物的抗旱性,。褪黑素還通過GA信號(hào)傳導(dǎo)與GA發(fā)生串?dāng)_,，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的生物合成途徑。油菜素類固醇,，如24-EBL以其在植物（包括干旱）中的非生物脅迫保護(hù)作用而聞名,。此外，褪黑激素通過刺激各種BR生物合成基因,，如DWARF4,，D11和RAVL1，來調(diào)節(jié)BR的生物合成,。茉莉酸在植物的非生物脅迫耐受性中起著至關(guān)重要的作用,，在本研究中，JA水平受干旱和褪黑素的正向調(diào)控,。該研究結(jié)果突出了JA在干旱條件下的應(yīng)激保護(hù)作用,。我們還發(fā)現(xiàn)到干旱脅迫下ABA的上調(diào)，但是褪黑素處理后ABA的水平被下調(diào),。通常,，在干旱條件下會(huì)刺激ABA的生物合成，并導(dǎo)致關(guān)鍵代謝途徑的下調(diào),。ABA生物合成增加歸因于關(guān)鍵生物合成基因NCED3（9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶3）的正向調(diào)控,。ABA也是ROS生成途徑的重要信號(hào)分子，其積累與氧化應(yīng)激的增強(qiáng)直接相關(guān),。然而,，褪黑素是ABA生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)劑，也是ABA分解代謝的正調(diào)節(jié)劑,。

圖8.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植物中植株生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響,。代謝物調(diào)節(jié)熱圖（A）和代謝物調(diào)節(jié)的相對(duì)比較（B）,。正比例表示代謝產(chǎn)物的上調(diào)，而負(fù)比例表示代謝產(chǎn)物的下調(diào),。ZT,，玉米素；GA14,，赤霉素A14,；24-EBL，24-表油菜素內(nèi)酯,；6-OHM,，6-羥基褪黑激素；JA,，茉莉酸,； ABA，脫落酸,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD,，具有相同字母的均值在P ≤.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異。（CN,，對(duì)照組,；P3，30％聚乙二醇,；M,，100 μM褪黑激素；MP3,，M + P3）,。（PEG處理后40天）。

7 褪黑素調(diào)節(jié)干旱條件下酶的基因表達(dá)

褪黑激素和干旱脅迫均調(diào)節(jié)了編碼抗氧化酶,，葉綠素酶和苯丙氨酸解氨酶的各種基因的表達(dá)（圖9）,。褪黑素處理和干旱脅迫上調(diào)了SOD，CAT,，APX和PAL的表達(dá),，且SOD的最大表達(dá)增加量（與對(duì)照相比）為56.0％（MP2與對(duì)照，圖9A）,，CAT的最大表達(dá)增加量為84.9％（M與對(duì)照,，圖9B），APX的最大表達(dá)增加量為80.7％（M與對(duì)照對(duì)照,，圖9D）和PAL的最大表達(dá)增加量為202.7％（P2與對(duì)照,，圖9F）。在嚴(yán)重干旱脅迫下生長(zhǎng)的褪黑素預(yù)處理植株中觀察到POD表達(dá)急劇增加（圖9C）。CHLASE表達(dá)被干旱脅迫上調(diào)（與對(duì)照相比,，P2中增加了45％）,，而與P2組相比，褪黑激素處理導(dǎo)致MP2組中CHLASE表達(dá)下調(diào)了20.1％（圖9E）,。褪黑激素介導(dǎo)的基因水平調(diào)節(jié)可歸因于關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié),，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)通路，其在干旱條件下也受到褪黑素的調(diào)節(jié),。此外,，褪黑激素在干旱脅迫下對(duì)氮代謝的調(diào)節(jié)也有助于形成含氮分子（即核酸）,。編碼抗氧化酶的關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)與抗氧化酶的活性有關(guān),，這有助于在脅迫條件下細(xì)胞中的氧化還原平衡。

圖9.褪黑素處理對(duì)干旱脅迫下山核桃植株基因表達(dá)的影響,。SOD,，超氧化物歧化酶；CAT,，過氧化氫酶,；POD，過氧化物酶,；APX,，抗壞血酸過氧化物酶；CHLASE,，葉綠素酶,；PAL，苯丙氨酸氨裂合酶,。數(shù)據(jù)表示為均值±SD,，具有相同字母的均值在P ≤.05時(shí)彼此之間沒有顯著差異。CN,，對(duì)照組,；P2，10％聚乙二醇（PEG）,；P3,，30％PEG；M,，100 μM褪黑素,；MP2，M + P2,；MP3,，M + P3。（PEG處理后40天）。

這項(xiàng)研究表明,，褪黑素調(diào)節(jié)植物的關(guān)鍵生理,，生化和分子過程，從而賦予植物抗旱性,。當(dāng)與前期工作結(jié)合發(fā)現(xiàn),，本研究的結(jié)果表明褪黑激素與植物激素發(fā)生串?dāng)_，以調(diào)節(jié)干旱脅迫下植物的各種生理和分子過程,。褪黑素還調(diào)節(jié)干旱脅迫植物的代謝途徑,。因此，這種多元化的分子可以通過最小化與代謝物生物合成的破壞相關(guān)的負(fù)面影響來改善干旱脅迫的植物產(chǎn)品的質(zhì)量,。園藝家可能因使用褪黑素來提高植物的耐旱性并改善農(nóng)作物的質(zhì)量而受益,。

原文網(wǎng)址：https://www./science/article/pii/S0048969720301856