不可否認(rèn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)占據(jù)了生物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的半壁江山,。要想探究材料的生物相容性,，最基礎(chǔ)的細(xì)胞活死染色+增殖實(shí)驗(yàn)必不可少；探究基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞的形態(tài)影響，細(xì)胞增殖+分化實(shí)驗(yàn)是重要的一環(huán),；探究材料對細(xì)胞增殖的抑制情況（如癌細(xì)胞等）,，同樣也需要細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證……其中，對細(xì)胞活性和增殖的檢測能夠直觀反映材料,、相關(guān)化合物或外界條件刺激下細(xì)胞的生長狀態(tài),，是評估材料毒性、藥物活性和治療效果的基本方法,，被廣泛應(yīng)用于生物材料以及醫(yī)療器械研發(fā)領(lǐng)域,，同時也是生命科學(xué)研究中最基礎(chǔ)的手段之一。

目前,，常用的細(xì)胞活性與增殖檢測方法包含計(jì)數(shù)法、比色法,、DNA測定法,、ATP檢測法、熒光探針法等,。但各種方法都有著其自身的局限性與優(yōu)缺點(diǎn),，因此選擇合適的方法檢測細(xì)胞活性也是十分必要的。本期EFL為大家?guī)砹思?xì)胞活性檢測方法的詳細(xì)總結(jié),！

直接計(jì)數(shù)法是細(xì)胞活性檢測的最基礎(chǔ)方法之一,，利用計(jì)數(shù)板即可獲取細(xì)胞數(shù)目，操作相對簡單,，可用于細(xì)胞生長曲線的繪制,。細(xì)胞的直接計(jì)數(shù)法，凡是做過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的應(yīng)該都不陌生,，可以說是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的必修課，因此，這里不作過多介紹~

但直接計(jì)數(shù)法無法區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞,，且沒有一張漂亮的染色圖片作為數(shù)據(jù)的有力支撐,！為此,，我們將臺盼藍(lán)染色法和中性紅染色法歸為直接計(jì)數(shù)法。當(dāng)然,，這兩種方法也可稱為細(xì)胞膜通透性測定法或染料排斥法,。由于細(xì)胞膜的選擇性,，活細(xì)胞不允許臺盼藍(lán)透過,，因此只有死細(xì)胞才會顯示為獨(dú)特的藍(lán)色（圖1）,；類似的,，活細(xì)胞對中性紅具有一定的攝入能力，一旦細(xì)胞受到傷害攝入能力就會下降,。

因此,，可以在染色后，通過顯微鏡觀察計(jì)數(shù)從而確定細(xì)胞存活數(shù)量,。但這種方法無法區(qū)分增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞，只適合辨別細(xì)胞的基礎(chǔ)活性（活/死細(xì)胞）及其細(xì)胞膜的完整性,。

圖1 臺盼藍(lán)染色^[1]

與細(xì)胞計(jì)數(shù)法相比，比色法的操作簡單,、檢測速度快,，同時適用于樣本數(shù)量較多的檢測。目前,，常用的比色方法如表1：

其中,，MTT、WST-1,、CCK-8三種檢測方法的原理基本一致,，利用細(xì)胞線粒體內(nèi)的酶將檢測試劑還原為有色產(chǎn)物，隨后測量相應(yīng)的OD值即可,，其與細(xì)胞活性（數(shù)量）成正比,。但MTT還原的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需進(jìn)一步使用DMSO等有機(jī)溶劑溶解,，既增加了工作量也會對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性產(chǎn)生影響,；WST-1法所產(chǎn)的甲臜是水溶性，因而相對于MTT法更方便、數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確,；而CCK-8可直接加入細(xì)胞樣品中,，無需洗滌等操作、無需有機(jī)溶劑,、靈敏度高,、對細(xì)胞毒性小、既可用于懸浮細(xì)胞也可用于貼壁細(xì)胞,，相比之下,，擁有較多優(yōu)點(diǎn)的CCK-8法無疑是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞活性檢測方法,！

而SRB法和LDH法相對中規(guī)中矩,，它們都有著各自的主要功能,。SRB是一種易溶于水的粉紅色陰離子染料，酸性條件下與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合,，其OD值可用作細(xì)胞的定量檢測；而LDH釋放主要是由于細(xì)胞膜的完整性喪失,，而這又是細(xì)胞壞死的標(biāo)志,，因此LDH通常用來檢測細(xì)胞壞死情況,。

通過直接測定細(xì)胞的DNA合成含量來評價細(xì)胞的增殖能力，這種方法被認(rèn)為是最精確的檢測增殖方法之一,。目前,，關(guān)于DNA合成測定主要有兩種方式：“替身”和“定位”,。

“替身”其一是BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷,，一種胸腺嘧啶的衍生物），能夠代替正常的胸腺嘧啶參與細(xì)胞DNA復(fù)制過程,，BrdU的特異性抗原可以用于檢測BrdU的摻入,，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。但這種技術(shù)需要對雙鏈DNA進(jìn)行變性處理（酸變形,、熱變性等），可能會對細(xì)胞形態(tài)造成影響,；“替身”的另一種方式,，EdU（5-乙炔基-2’-脫氧鳥苷），無需特殊條件處理（酸解、熱解等）,，可以避免樣品損傷,，有助于觀察細(xì)胞增殖的真實(shí)水平，具有更快的靈敏度和檢測速度（圖2）,。

圖2 EdU方法評估細(xì)胞增殖^[2]

“定位”指的是給DNA安裝“定位器”,，胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，用同位素3H標(biāo)記TdR后即可成功參與DNA合成代謝過程,，就像是被安裝了定位器,，通過測定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，即可反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況,。雖然這種方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性高,，但需要一定的設(shè)備條件~

ATP含量測定也被稱為化學(xué)發(fā)光法。ATP是細(xì)胞能量的直接來源,，通過檢測細(xì)胞中ATP的含量可以直接反應(yīng)細(xì)胞的增殖,、活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞死亡時,，ATP會迅速水解,，借助ATP依賴的螢光素酶催化的螢光素發(fā)光反應(yīng)測量其發(fā)光值，發(fā)光值與ATP量成正比,，ATP又和活細(xì)胞數(shù)正相關(guān),，因而可以通過檢測ATP間接檢測細(xì)胞活力。如圖3所示,，早期凋亡細(xì)胞內(nèi)的ATP水解,，因而濃度升高。

圖3 早期凋亡細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度^[3]

目前,，主要開發(fā)了兩種使用較為廣泛的活細(xì)胞熒光探針：CFDA-SE和Calcein AM,。①CFSE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯）能夠被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，其本身不具備熒光,，直至被細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解以產(chǎn)生熒光,，它既可用于細(xì)胞示蹤，也可用于細(xì)胞增殖檢測,。在加入熒光探針大約24 h后即可充分標(biāo)記細(xì)胞,，而且熒光能夠穩(wěn)定標(biāo)記長達(dá)數(shù)月。②另一種常用的熒光探針為Calcein AM,，增強(qiáng)的疏水性使其能夠輕松穿過細(xì)胞膜,，被細(xì)胞內(nèi)酯酶快速水解從而生成具有綠色熒光的Calcein分子進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。如圖4所示,，在特定條件下利用Calcein AM對Hela細(xì)胞的活性進(jìn)行了檢測,。特別的,，Calcein AM的細(xì)胞毒性非常低，對pH的敏感性低,。因此,，Calcein AM是目前最理想的活細(xì)胞熒光探針之一。

圖4 利用Calcein AM探針檢測Hela細(xì)胞活性^[4]

綜上,，本期主要介紹了5種主要的細(xì)胞活性與增殖檢測方法,，那么如何選擇最適合的方法呢？其實(shí),，最佳的檢測方法取決于多種因素,。基于比色法的檢測原理，有時難以判斷OD值的高低是因?yàn)榛罴?xì)胞數(shù)量變化還是細(xì)胞脫氫酶的活性變化,，最好兩種或多種檢測方法相互驗(yàn)證,；如果只需要了解細(xì)胞增殖中代謝活性物質(zhì)，使用比色法中的兩種足矣,；但若想深入研究一下DNA,，則可以使用DNA合成測定標(biāo)記后，在結(jié)合其他方法進(jìn)行進(jìn)一步的分析…總之,，實(shí)驗(yàn)道路千萬條,，總有一條適合自己！

Ref.

[1] Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy ACS Nano 2019, 13 (10), 11249-11262

[2] The circRNA circSEPT9 mediated by E2F1 and EIF4A3 facilitates the carcinogenesis and development of triple-negative breast cancer. Mol Cancer 2020, 19, 73.

[3] Intracellular transport is accelerated in early apoptotic cells Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2018, 115(48), 12118.

[4] High Carbonization Temperature to Trigger Enzyme Mimicking Activities of Silk-Derived Nanosheets Small 2020, 16, 2004129.