01

摘要

花青素是授粉和種子傳播的視覺線索,。含有花青素的水果也因其外觀和健康益處而吸引消費者。在獼猴桃（獼猴桃屬）中,，研究已經(jīng)確定了至少兩種花青素 MYB 激活劑,，但它們在水果中的功能以及它們的作用機制尚不完全清楚,。

在這里，轉(zhuǎn)錄組和小 RNA 高通量測序被用于全面鑒定獼猴桃中花青素積累的貢獻(xiàn)者,。

在葡萄藤中穩(wěn)定的過表達(dá)表明,，35S::MYB10和MYB110都可以上調(diào)獼猴桃果實中花青素的生物合成，并且MYB10的過表達(dá)導(dǎo)致花青素積累僅限于內(nèi)果皮,，表明抑制機制是該物種花青素生物合成的基礎(chǔ),。此外，MYB10/110的 C 末端區(qū)域中的基序被證明與花青素反應(yīng)的激活強度有關(guān),。瞬時分析表明MYB10和MYB110 均不被 miRNA 直接切割,，但 miR828 及其定相小 RNA AcTAS4-D4(-) 有效靶向MYB110。鑒定了在內(nèi)果皮和外果皮之間差異表達(dá)的其他miRNA,，并觀察到SPL13,、ARF16、SCL6和F-box1的切割,，這些都是MYB10的阻遏物,。

我們得出結(jié)論，是 MYB 激活劑的差異表達(dá)和隨后的抑制導(dǎo)致獼猴桃物種中花青素積累的變化,。

02

技術(shù)路線

Hongyang’ (Actinidia chinensis) kiwifruit at colour change stage

Kiwifruit and Nicotiana benthamiana total RNA extraction

First-Strand cDNA synthesis and RT-qPCR (Real-Time Quantitative PCR)

High-throughput sequencing and analysis

Kiwifruit stable transformation

Genome synteny and collinearity Analysis

Isolation and cloning of candidate genes and MIRNAs

Transient over-expression in Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana plants

Dual-luciferase assays

Anthocyanin extraction and quantification

Firefly luciferase complementation imaging assay (LCI)

03

主要結(jié)果

3.1 紅陽獼猴桃花色素苷代謝關(guān)鍵基因的鑒定

授粉10周后,，花青素在“紅陽”果實的內(nèi)果皮中明顯積累（圖1a）。通過RNA高通量測序,，以探索基于高質(zhì)量參考基因組（Red5）的關(guān)鍵基因,。根據(jù)先前的研究總結(jié)了編碼生物合成酶的花青素相關(guān)基因（圖1b，補充表S6）,。進一步的分析表明,，F(xiàn)3H1、F3H2,、F3’5'H、F3GT1和GST1與發(fā)育系列和差異組織中花青素積累的視覺觀察結(jié)果呈正相關(guān)（圖1a,，補充圖S1）,。

我們根據(jù)共表達(dá)基因的表達(dá)模式（R≥0.6，圖1c）,，以及它們在獼猴桃基因組中的位置,。從該分析中，我們發(fā)現(xiàn)279個基因與所有這五個花青素相關(guān)基因共表達(dá)（補充圖S2a,，b,；補充表S2）。這些基因在發(fā)育和空間上都受到調(diào)控,，在內(nèi)果皮中高度表達(dá),，表明受轉(zhuǎn)錄調(diào)控,。

PlantTFDB（植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫）用于分析279個基因，其中17個被預(yù)測為轉(zhuǎn)錄因子,，包括NAC,、AP2、MADS和MYB（補充圖S3a,、b,；補充表S2）。所有轉(zhuǎn)錄因子都被克隆,，并在煙草葉中瞬時過表達(dá),。17種TF與花青素積累相關(guān)，但只有MYB10激活了煙草中的花青素水平,。使用MYB110作為對照,，其具有比MYB10更強的激活作用（補充圖S4）。然而,，其他16種TF中沒有一種有助于MYB10活性（補充圖S5）,，事實上有三種是強阻遏物（Acc23145/HSFB3、Acc25983/C2H2-82和Acc29865/MYB223）,。共表達(dá)分析的預(yù)測包括MYB10,，實時定量PCR（RT-qPCR）證實了這一點，該PCR顯示MYB110的轉(zhuǎn)錄水平在整個果實發(fā)育過程中在內(nèi)果皮中較高（圖1d）,。因此,，轉(zhuǎn)錄組和瞬時分析支持MYB10在“紅陽”水果著色中的重要性。

Fig. 1

3.2 獼猴桃中MYB10和MYB110的過度表達(dá)揭示了不同的功能

獼猴桃（品種A.chinensis cv.Hort16A）中35S:：MYB10和35S::MYB110的穩(wěn)定過表達(dá)增加了葉片中的花青素含量,。盡管在“紅陽”中未檢測到MYB110,，但基于RNA seq或RT-qPCR（補充圖S6a，b）,，我們的結(jié)果表明,，MYB10和MYB11在過度表達(dá)時，都會產(chǎn)生積累花青素的果實（圖2）,。對照品系保留黃色果肉,，類似于果園種植的“Hort16A”果實。

MYB10過表達(dá)植物的果實在內(nèi)部果皮中積累花青素（圖2）,，盡管MYB110由組成型35S啟動子驅(qū)動,。RT-qPCR用于比較外果皮和內(nèi)果皮之間的轉(zhuǎn)錄水平，這表明轉(zhuǎn)基因在整個果實中表達(dá)良好,，但在內(nèi)果皮中表達(dá)稍高（補充圖S7）,。因此，這些MYB10過度表達(dá)的水果現(xiàn)象復(fù)制了“紅陽”水果的自然外觀,。相比之下,，MYB110過表達(dá)系在果肉和皮膚的所有區(qū)域都積累了花青素（圖2）,，這反映出了黑木耳和黑木耳的紅色肉質(zhì)選擇，其中MYB10已被觀察到表達(dá),。RT-qPCR顯示MYB110在外果皮和內(nèi)果皮中組成性表達(dá)（補充圖S7）,。因此，MYB10和MYB110似乎足以激活獼猴桃屬植物的花青素,。MYB10和MYB110在果實中過度表達(dá)時的表型表明,，潛在的阻遏物控制花青素合成和最終外觀。

Fig. 2

3.3 獼猴桃中MYB10和MYB110的進化分析揭示了激活花青素生物合成的關(guān)鍵基序

系統(tǒng)發(fā)育分析表明,，MYB10和MYB110是同源基因,，它們與另一個MYB（Acc10227）聚集成一個亞組（補充圖S8）。Acc10227（MYB210）已在獼猴桃雜交種群中鑒定,，與MYB110緊密相關(guān),。這些結(jié)果暗示了一種潛在的遺傳關(guān)系。MCscanX用于檢測獼猴桃基因組中是否存在共線性,。有趣的是,，分析顯示，在一個分別含有MYB10和MYB110/210的區(qū)域,，Chr01:6720929-9462208和Chr09:5346916-7131334顯示了大規(guī)模連鎖（圖3a）,。微合成圖顯示MYB110和MYB210位于Chr09:5346916-7131334上，緊密連接但不直接連接,。分析表明MYB10和MYB210是直接共線的,。此外，MYB110和MYB210更可能是近端重復(fù)的產(chǎn)物,。MYB10和MYB110在不同的獼猴桃中表達(dá),，它們在進化過程中趨向于亞功能化（導(dǎo)致不同的紅色果實表型）；MYB210在花瓣,、肉或其他組織中未檢測到,，因此可能沒有功能。

對MYB10和MYB110蛋白序列的比較顯示了C末端區(qū)域的差異（圖3b）,。MYB10和MYB110都含有一個非常相似的R2R3結(jié)構(gòu)域,，以及一組C端殘基，分別稱為MYB11基序和MYB110基序（圖3b）,。為了測試這些MYB10-或MYB110基序是否影響花青素誘導(dǎo)的效率，我們交換了基序或?qū)⑵鋸木幋a序列中刪除（圖3b）,。瞬時分析表明,，MYB110基序可以增加MYB10的花青素積累水平（MYB10C，圖3c,，d）,，而攜帶MYB12基序的MYB11在花青素誘導(dǎo)方面表現(xiàn)出顯著損失（MYB110C,，圖3c，d）,。此外,，當(dāng)C端基序缺失（MYB110D和MYB10D）時，滲透導(dǎo)致花青素誘導(dǎo)很少（圖3c,，d）,。因此，MYB10/110的C末端的基序被顯示為影響花青素產(chǎn)生的強度,。

Fig.3

3.4 “紅陽”果實抑制性轉(zhuǎn)錄過程的鑒定

盡管MYB10在整個果實中都有表達(dá),，但過表達(dá)MYB110的果實的色素沉著模式與“紅陽”果實表現(xiàn)出相似的外觀。這表明,，由MYB10表達(dá)驅(qū)動的花青素積累進一步受到抑制機制的影響,，這種抑制機制在外果皮中表現(xiàn)得更強。此外,，MYB110在“紅陽”果實中不表達(dá),。因此，分析了MYB10和MYB110的潛在阻遏物,。

進行小RNA測序以檢測“紅陽”果肉中表達(dá)的miRNA,。發(fā)現(xiàn)了近2800個具有潛在前體的成熟miRNA。主成分分析（PCA）表明,，內(nèi)果皮和外果皮在PCA2維度上有區(qū)別（圖4a）,。共表達(dá)分析顯示，授粉后10周和12周（WAP）,，當(dāng)比較外果皮和內(nèi)果皮中的miRNA水平時,，15個miRNA上調(diào)，5個下調(diào)（圖4b,，c,；補充表S7）。然而,，預(yù)測分析（使用psRobot軟件）表明,，這些不同表達(dá)的miRNA不能直接切割MYB10或MYB110。發(fā)現(xiàn)MYB11和MYB12與AtMYB75（AtPAP1）和AtMYB90（PAP2）同源,，已證明其受相iRNA AtTAS4-siR81（-）調(diào)控,。

Fig. 4

在小RNA測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一種類似于AtTAS4-siR81（-）的小RNA，具有四個核苷酸差異（補充圖S10a）,。該推測的小RNA被預(yù)測與MYB110（補充圖S10b）有效結(jié)合,，但與MYB1 0無效。推測的小RNA位于Chr05:14577221-14577201上，然后延伸300 bp至側(cè)翼區(qū)域,，其中發(fā)現(xiàn)了miR828靶位點（圖5a）,。在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的小RNA，這觀察到了階段RNA的生成規(guī)律（補充圖S11）,。因此,，我們將該區(qū)域視為AtTAS4的同源基因座，它包含位于D4（-）區(qū)域的假定小RNA,，我們稱其為AcTAS4-D4（-）,。檢測到五種潛在的miR828前體（稱為MIR828a-e），其中兩種類型的成熟miR826是由這些前體產(chǎn)生的,。miRNA活性的雙熒光素酶分析支持這五種前體產(chǎn)生成熟的miRNA（miR858a至e）,，隨后切割A(yù)cTAS4（圖5b）。

將含有MIR828a,、AcTAS4和MIR829a+AcTAS44的農(nóng)桿菌滲透到本氏菌葉片中,。RT-qPCR檢測葉片中phasiRNA的生成；當(dāng)用空載體或MIR828a注射時,，在煙葉中不能檢測到AcTAS4-D4（-）,。然而，當(dāng)MIR828a和AcTAS4的混合物被滲透時,，AcTAS4-D4（-）的豐度顯著增加,。單獨滲透的AcTAS4也會導(dǎo)致AcTAS4-D4（-）出現(xiàn)，這可能由內(nèi)源性煙草miR828觸發(fā)（圖5c）,。此外,，miRNA雙熒光素酶分析進一步顯示AcTAS4-D4（-）可以有效切割MYB110（圖5d）。MYB10和MYB110是擬南芥亞群S6 MYB的同源物,。在先前的研究中,，AtMYB75（AtPAP1）、AtMYB 90（AtPAP2）和AtMYB113被預(yù)測受AtTAS4-siR81（-）調(diào)控,。

Fig. 5

在獼猴桃中,，MYB110被TAS4位點產(chǎn)生的phasiRNA切割，盡管與擬南芥有一些核苷酸差異（圖6a）,。然而,，分析表明MYB10將逃脫AcTAS4-D4（-）和AtTAS4-siR81（-）的切割（圖6a）。當(dāng)與AcTAS4-D4（-）共滲透時,，MYB110的花青素誘導(dǎo)活性顯著降低（圖6b,；補充圖S12a），但對MYB10驅(qū)動的花青苷積累沒有影響（圖6a,；補充圖S2b）,。當(dāng)MYB110中AcTAS4-D4（-）的靶位點突變時，在不改變氨基酸序列的情況下（補充圖S13），它不再受AcTAS4-D4（-1）的調(diào)控,。過度表達(dá)結(jié)果表明，MYB110在獼猴桃中產(chǎn)生暗紅色愈傷組織,，而MYB110m產(chǎn)生黑色愈傷組織（圖6c）,。MYB110m愈傷組織中的花青素積累量是MYB110的三到六倍（圖6d和e），雖然呈黑色,，但提取時呈深紅色,。

Fig. 6

3.5 miRNA靶向介導(dǎo)的miRNA對MYB10的抑制

由于MYB10不受表達(dá)的miRNA或AcTAS4-D4（-）直接調(diào)控，我們研究了可能影響MYB12活性的其他抑制機制,。研究了涉及miRNA的其他靶點的間接調(diào)控,。根據(jù)我們的目標(biāo)預(yù)測（通過psRobot軟件），每個miRNA通常針對一類特定的基因,，其中許多是轉(zhuǎn)錄因子（補充表S3）,。這些轉(zhuǎn)錄因子包括SQUAMOSA啟動子結(jié)合蛋白樣（SPL）、生長素應(yīng)答因子（ARF）,、SCL和APETALA2（AP2）,。為每個miRNA選擇一個有代表性的靶基因，然后進行miRNA雙熒光素酶測定,，以確定這些基因是否被相應(yīng)的miRNA直接抑制,。

實驗證實所有靶轉(zhuǎn)錄因子都被相應(yīng)的差異表達(dá)miRNA（DEmiRNA；圖7a）切割,。為了測試DEmiRNA對花青素積累的間接調(diào)節(jié),，在miRNA結(jié)合位點突變所有靶基因（氨基酸序列未改變），以防止由同源內(nèi)源性煙草miRNA驅(qū)動的任何影響（補充圖S14）,。

使用這些突變的TF構(gòu)建體,，進行顯色瞬時分析，以評估靶點對MYB10的抑制作用,。顯色分析清楚地表明SPL13（Acc29651,；或SQBP28）、ARF16（Acc08534）,、SCL6（Acc15797,；或GRAS76）和F-box1（Acc08265）可有效抑制MYB12（圖7b；補充圖S15）,。其中,，ARF16和F-box1的效果最為顯著，而SPL13和SCL6可以將花青素積累減少到40-50%（圖7b,；補充圖S15）,。這些結(jié)果表明，一組抑制性轉(zhuǎn)錄因子本身是miRNAs的靶標(biāo)，可以介導(dǎo)MYB10蛋白活性的抑制,，并可能在果實外果皮中起作用,。

Fig. 7

3.6 miRNA靶向抑制MYB10是通過MBW轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中MYB110的競爭實現(xiàn)的

從煙草中花青素積累的結(jié)果來看，一組miRNA靶點通過抑制MYB10蛋白影響花青素的積累,。亞群6分支的MYB通過形成MYB-bHLH-WD40復(fù)合物控制花青素生物合成,。因此，進行熒光素酶測定以測試miRNA靶點是否改變MBW復(fù)合物,。熒光素酶的C端（CLUC）或-N端（NLUC）與靶蛋白或MBW復(fù)合物的成員融合,。正如預(yù)期的那樣，SPL13（Acc29651）,、ARF16（Acc08534）,、SCL6（Acc15797）和F-box1（Acc08265）的過度表達(dá)顯著降低了MYB10和bHLH5的相互作用（獼猴桃bHLH4，Acc19563,；圖8a）,。四種最強的抑制因子中有三種是轉(zhuǎn)錄因子SPL13、ARF16和SCL6,。

此外,，螢火蟲熒光素酶互補分析支持SPL13，ARF16及SCL6可以結(jié)合MYB10蛋白形成蛋白-蛋白復(fù)合物（圖8b）,。因此,，似乎miRNA靶點SPL13、ARF16和SCL6可以通過與MBW復(fù)合物競爭MYB10來抑制花青素積累,。F-box1（Acc08265）蛋白被注釋為屬于E3泛素連接酶家族的蛋白質(zhì),，其參與蛋白質(zhì)降解。F-box1能夠減少由MYB10驅(qū)動的花青素積累并干擾MBW復(fù)合物（圖7b,，8a）,。

此外，F(xiàn)-box1的過度表達(dá)導(dǎo)致MYB10-LUC融合蛋白的熒光素酶活性降低（圖8c）和MYB10蛋白降解（圖8d）,。這些結(jié)果表明,，F(xiàn)-box1通過泛素化途徑直接靶向MYB10蛋白降解。因此,，miRNA靶點F-box1也可以通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換影響MYB10,。

Fig. 8

04

結(jié)論

獼猴桃果肉中花青素的外觀由兩種MYB激活劑MYB10（紅色內(nèi)果皮）和MYB110（紅色全果肉）確定（圖9）。MYB10和MYB110可能起源于祖先的MYB,，在基因復(fù)制后具有亞功能化,。蛋白質(zhì)C末端的兩個關(guān)鍵基序被表征并直接影響MYB活性的強度。MYB110被小RNA AcTAS4-D4（-）直接切割,，由miR828觸發(fā),。MYB10被miRNA的基因靶標(biāo)廣泛抑制,，這些miRNA在外果皮中的表達(dá)低于內(nèi)果皮，導(dǎo)致MYB11抑制,。這項研究揭示了獼猴桃色素沉著的激活抑制系統(tǒng),。

Fig. 9

05

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