免疫學分析主要包括免疫組織化學染色（IHC）和流式細胞術(shù)（FCM）,，方法是采用不同染料或熒光染料標記的單克隆抗體（單抗，mAb）對細胞懸液,、細胞涂片或骨髓組織切片進行染色,，然后在流式細胞儀或熒光顯微鏡或光鏡下觀察細胞表面或細胞內(nèi)的抗原標記。

免疫分析技術(shù)是確定血液腫瘤細胞系列,，如T淋巴細胞,、B淋巴細胞、髓系細胞,、自然殺傷（NK）細胞,、自然殺傷性T（NKT）細胞、淋巴樣漿細胞,、漿細胞,、樹突細胞（DC）和非血液淋巴系統(tǒng)細胞等的關(guān)鍵技術(shù)。尤其是雙表型,、雙克隆性、甚至多系列的血液腫瘤只能通過免疫學分析來診斷,。

該技術(shù)也是確定血液腫瘤細胞分化受阻階段（早期或前體或原始,，晚期或成熟或外周）的關(guān)鍵技術(shù),。以急性白血病為例，如果形態(tài)學,、細胞化學染色聯(lián)合FCM,，診斷與分型的準確率及一致率可達90%以上，且重復性高,。

急性白血病病情發(fā)展速度很快,，甚至可能在一天之內(nèi)迅速惡化，因此需要快速診斷并治療,。根據(jù)形態(tài),、細胞化學染色和FCM對急性白血病的診斷和分類，最快幾個小時就可明確疾病診斷,，醫(yī)生可先根據(jù)這兩份結(jié)果對患者進行治療,，避免延誤急性白血病的治療時機。

IHC一般每次染色只能用一種抗體,，但很少有一種免疫標志是惡性細胞特有的標志,。

在免疫標記染色后，細胞形態(tài)特點不清楚,，很難在不同染色切片對同一類細胞定位并確定這類細胞表達的全部標志,，尤其是對那些不破壞組織結(jié)構(gòu)的血液腫瘤細胞、或血液腫瘤細胞沒有定位于特定的組織結(jié)構(gòu)區(qū)域,，與反應性良性細胞混合分布的病理標本,。

此外,，在血液腫瘤細胞比例明顯比正常細胞少的情況下，僅根據(jù)IHC難以鑒定細胞的良惡性,、惡性細胞的細胞系列及分化階段,；目前有些抗體很難成功用于IHC染色和分析，如T細胞抗原受體（TCR）αβ或γδ鏈,、免疫球蛋白輕鏈,、TCRvβ區(qū)，因此采用IHC很難診斷γδT淋巴瘤,，也很難進行成熟B細胞,、T細胞的克隆性分析。

同樣,，IHC的診斷醫(yī)生需要具有組織病理醫(yī)生那樣豐富的知識和經(jīng)驗,，還要了解IHC染色試劑的優(yōu)缺點。

流式細胞儀除了直接探測細胞的大小,、細胞內(nèi)顆粒的多少外,，還可一次性檢測同一個細胞上3～10余種免疫標志是否表達、表達強度,、不同免疫標志之間的關(guān)系,。

如果含有不同細胞群的標本在同一試管染不同的熒光標記的抗體，那么就可以劃出有同樣熒光標記的一群細胞所在區(qū)域（設(shè)門）,，然后分析和計算該細胞群的特征和數(shù)量,。

FCM可以在幾個小時內(nèi)完成對同一患者幾十萬個細胞上數(shù)百種標記的分析，比IHC更為快速,、簡便,，一致性及重復性更好。

FCM可檢測多種標本,，如血液,、骨髓、活檢組織、各種細針或粗針穿刺標本,、胸水,、腹水,、腦脊液等多種體液,，因此容易檢測血液腫瘤在其它部位的浸潤。

雖然血液腫瘤細胞上的單個免疫標志與正常細胞差異很小,，但是綜合多種免疫標志的分析,，大多數(shù)的惡性血液細胞具有一些異常表達的現(xiàn)象，可幫助判斷細胞的良惡性,。而與形態(tài),、組織病理、IHC相比,，F(xiàn)CM更容易判斷細胞的良惡性,。

例如，惡性成熟B細胞和惡性漿細胞膜或胞漿限制性表達單一的免疫球蛋白（Ig）輕鏈（κ或λ）,，而正常成熟 B細胞膜或漿細胞胞漿內(nèi)表達κ或λ的細胞比例一般為3:2,；正常成熟 T細胞上 T細胞抗原受體抗原（TCR）為多克隆表達，而惡性T細胞 TCR抗原為某一克隆明顯增加,，其它克隆明顯減少,；血液腫瘤細胞還可有脫氧核糖核酸（DNA）倍體異常、抗原表達過強,、應該表達的抗原丟失,、不同系列細胞的抗原同時表達、早期晚期抗原同時表達,、罕見細胞（如TCRγδ+T細胞等）明顯升高等,。

在此基礎(chǔ)上，也更容易判斷惡性細胞的系列來源及成熟階段,。因為很多免疫標志在正常細胞上也存在,，因此進行血液腫瘤免疫分型時應該確定免疫標志在血液腫瘤細胞上，而不是簡單地根據(jù)某一免疫標志的細胞的數(shù)量來判斷,。

尤其是當組織中存在大量的正常細胞,，腫瘤細胞比例很低時；或有正常早期細胞標志的細胞反應性增加時,；單純用IHC判斷腫瘤細胞的系列來源及分化階段可能誤診,。

比如，當原始細胞只有20%,，而正常粒細胞≥50%時,，此時根據(jù)粒細胞標志細胞占全部有核細胞（ANC）的比例就診斷急性粒細胞白血病是完全錯誤的。

因此，很多免疫表型復雜的血液腫瘤用FCM來診斷比較容易,，用IHC診斷卻很困難,，比如同一患者存在多種惡性血液腫瘤克隆，如T,、B,、漿細胞、髓系共存,，淋巴瘤和急性白血病共存,，甚至有血液腫瘤和其它系統(tǒng)腫瘤共存的現(xiàn)象，如漿細胞腫瘤和肺癌共存等,。

FCM還可以對一些轉(zhuǎn)移癌等非造血系統(tǒng)腫瘤做出提示性診斷,，我們中心就使用FCM在組織、腦脊液,、骨髓,、血液等標本中查出過肺癌、神經(jīng)母細胞瘤等,。

由于FCM檢查的細胞數(shù)很多,，分析的標記多，F(xiàn)CM可以檢查很微量的血液腫瘤細胞,，敏感性可達10^-3~10^-4,；且覆蓋面廣，對>80%的血液腫瘤細胞都可用FCM檢測,，因此是監(jiān)測治療后微小殘留腫瘤（MRD）的最常用方法,，而且可以很快報告，及時調(diào)整治療方案,。

血液腫瘤細胞上的一些分化抗原決定簇（CD）,，如CD19、CD20,、CD22,、CD30、CD33,、CD38,、CD52、CD70,、CD138,、CD371、BCMA等,，針對這些抗原,，已經(jīng)有相應的抗體，嵌合性受體基因轉(zhuǎn)染的T細胞（CAR-T）等有效治療方法，因此檢測這些標記可幫助選擇靶向性的抗體或CAR-T治療,。

靶向治療后,，腫瘤細胞上的這些抗原還有可能丟失，因此監(jiān)測這些抗原的變化可指導更精確的靶向治療,。

有些免疫標志代表血液腫瘤的預后不好,，如 CD34+CD56+的急性髓系白血病（AML）,、混合細胞性急性白血?。∕PAL）等，因此免疫分型也有一定的預測預后的意義,。

與形態(tài)、組織病理及IHC相比,，F(xiàn)CM需要檢測液態(tài)細胞,，不能觀察到病理結(jié)構(gòu)，不能將細胞定位于組織部位,。一些太大的細胞,，如巨核細胞、霍奇金淋巴瘤細胞,、多核巨細胞等可能檢測不出,。一些無免疫標記異常的細胞也難以確定其良惡性，如一些紅白血病的幼紅細胞,。

此外,，F(xiàn)CM需要將標本處理成單個細胞懸液，并染色,，甚至洗滌,，一些血液腫瘤細胞在標本運送、處理過程中死亡（如幼紅細胞,、大B細胞淋巴瘤細胞容易破壞）,，可能檢測不到，或檢測的比例與形態(tài)或病理明顯不符,；腦脊液,、其它體液或組織的細胞，如果沒有血清等保護,，或時間較長也容易破壞,。

在比例方面，如果骨髓中正常幼紅細胞大量破壞,，會導致有核細胞比例失常,，腫瘤細胞比例高于形態(tài)或病理結(jié)果；如果腫瘤細胞破壞或標本稀釋則會導致腫瘤細胞低于形態(tài)或病理。另外,，抽骨髓時一般第一針首先抽少量骨髓血涂片進行形態(tài)學分析,，此后抽取骨髓血做染色體甚至基因，如果最后才抽取做流式分析,，會導致大量血液稀釋骨髓,。

一些惡性細胞與組織黏附性高，難以穿刺吸出或在組織標本時不能成為單個細胞懸液,，F(xiàn)CM也會漏診,。

還有值得注意的是，F(xiàn)CM診斷所用的有些標志如CCND1不如病理敏感,，因此診斷套細胞淋巴瘤要結(jié)合IHC,。很多類型的血液腫瘤有共同的免疫標志，如各類前體 B,、T,、髓系細胞腫瘤僅依據(jù)FCM尚不能對亞型作出準確診斷和分型。

FCM對診斷技術(shù)人員的要求也很高,，需要在以下多方面有豐富的知識和經(jīng)驗：血液病臨床特征,、正常細胞分化發(fā)育過程中免疫標志的變化規(guī)律、疾病的免疫標志特點,、不同廠家不同克隆號抗體及其標記的熒光光的特點,，不同熒光標記抗體組合后的變化，怎樣識別需要深入分析的目標細胞（設(shè)門）,，儀器及應用軟件的標準化,、調(diào)試等等。

目前FCM分析細胞參數(shù)時是一次性平面分析兩個參數(shù),，然后將多次的平面分析組合起來形成結(jié)論,，這也需要FCM診斷醫(yī)生有豐富的知識和經(jīng)驗。

FCM需要分析活的細胞,，需要的細胞數(shù)量多,，對活性不好的細胞容易出現(xiàn)非特異染色，細胞數(shù)量很少的標本容易導致分析不全面,，容易出現(xiàn)誤診或漏診,。

2008和2016世界衛(wèi)生組織造血與淋巴組織腫瘤分類的標準中提出了區(qū)分不同階段,、不同系列血液腫瘤的免疫標志特點。但是FCM判斷是否為血液腫瘤細胞不僅僅根據(jù)細胞上表達什么標志,，還要通過分析細胞上多種抗原表達和組合異常來判斷是否為血液腫瘤細胞,，然后再判斷血液腫瘤細胞的比例,、成熟階段及系列來源。

FCM診斷的正確性與標本處理方式,、儀器校準,、檢測抗體的選擇、抗體組合,、目標細胞的設(shè)門,、抗原表達比例及強度的判斷，診斷醫(yī)師分析的仔細程度,、知識水平及經(jīng)驗等因素都有關(guān),，目前國內(nèi)外不同單位的檢測結(jié)果尚不易被互認，尤其對血液腫瘤細胞比例很小的MRD的監(jiān)測,，差異及分歧很大,。國際上一些協(xié)作組監(jiān)測MRD時，一般僅選擇幾個實驗室來報告,。

為了減少不同實驗室之間的報告誤差,，國際上先后出臺了一些FCM診斷血液腫瘤的專家共識。國際血液學標準化委員會（ICSH）,、國際臨床流式學會（ICCS） 、歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)（ELN）,、英國血液學標準委員會（BCSH）等都制定了一系列的FCM診斷血液病的實踐指南,。

隨著FCM知識的普及，國內(nèi)FCM實驗室在診斷血液腫瘤方面有很大進步,，但是對淋巴瘤的診斷及分型,，很多腫瘤醫(yī)院或腫瘤科尚未把FCM列為常規(guī)診斷，因此尚需要努力普及宣傳這方面的知識,。