想要拿到一手有利用價(jià)值的科研報(bào)告和項(xiàng)目數(shù)據(jù),，前期的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和后續(xù)的分析都起著關(guān)鍵性的作用,。

然而有時(shí)候拿到報(bào)告不知道如何去解讀，這里為大家梳理一下16s科研項(xiàng)目的全過(guò)程,，幫助大家更好的了解報(bào)告內(nèi)容,，快速獲取關(guān)鍵信息。

還有多分組中，任意兩組之間比較：例如某實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了正常組,、疾病組,、用藥組服用奧氮平、阿立哌唑,、氨磺必利,、利培酮，像比較不同的用藥組和疾病組之間的菌群的差異結(jié)果,，就用到了分組之間兩兩差異比較,。

?舉個(gè)例子

圖中1組與3組、4組,、6組 組間差異顯著

還有隨時(shí)間的變化比較菌群之間的變化規(guī)律：例如在用藥不同時(shí)間段包括3天,，5天，2周,，1個(gè)月,，2個(gè)月，觀察菌群的變化情況,。如下圖所示：

如果前期搜集好每個(gè)樣本的相關(guān)理化指標(biāo),，還可以計(jì)算這些指標(biāo)與菌群之間是否具有相關(guān)性。

?舉個(gè)例子

在數(shù)值型理化指標(biāo)中,，孕期的天數(shù)與菌群之間相關(guān)性顯著*,，其次是白細(xì)胞介素6與菌群之間有相關(guān)性。

因此,，前期搜集相關(guān)資料越詳細(xì)充分,，對(duì)分析報(bào)告的完整性也會(huì)有幫助，分析人員也會(huì)根據(jù)您的樣本信息單提供的相關(guān)內(nèi)容,，做出個(gè)性化的分析和售后指導(dǎo)建議,。

首先基于樣本類型，最常見的環(huán)境樣本來(lái)源是人體,、動(dòng)物,、土壤、水體等,。而人體中的腸道菌群樣本是目前研究最廣泛,，可鑒定的物種也最為豐富，谷禾在腸道菌群與人體健康方面有深入研究,，目前已完成超20萬(wàn)例臨床腸道菌群樣本檢測(cè),，并構(gòu)建了超過(guò)60萬(wàn)各類人群糞便樣本數(shù)據(jù)庫(kù)。

其他樣本類型還包括人體/動(dòng)物唾液樣本,、組織樣本,、尿液樣本等。

? 糞便樣本

目前糞便樣本從采樣到提取數(shù)據(jù)分析技術(shù)較為成熟,、應(yīng)用較為廣泛,，谷禾最早在15年就開發(fā)了針對(duì)糞便樣本的取樣管，也是最早致力于研發(fā)糞菌取樣盒的公司,，方便實(shí)驗(yàn)室,、個(gè)人日常取樣需求，實(shí)現(xiàn)了糞菌樣本的常溫運(yùn)輸,。

谷禾取樣管常溫保存,，取樣也較為方便衛(wèi)生，在家就可以輕松完成,，相較于傳統(tǒng)取樣方法都有所升級(jí),。并且該取樣管也有專利證書。該取樣方法被大量客戶采用并接納,，大大降低了采集糞便樣本的難度,，縮短了搜集樣本的時(shí)間周期,。

取樣示意圖

? 其他樣本

土壤樣本也相對(duì)較為容易提取出DNA，但需要注意的是土壤樣本的菌群特征容易受植物腐殖質(zhì)基因的影響和干擾,，所以提取時(shí)要進(jìn)行純化,。

而口腔、組織,、尿液等樣本,，由于DNA含量較少，在實(shí)驗(yàn)階段提取相對(duì)較為困難,，所以提前準(zhǔn)備樣本時(shí),，盡量多取一些，并且可以多取幾個(gè)重復(fù),，盡量避免擴(kuò)增不出來(lái)的情況,。

并且這些樣還很容易受到環(huán)境樣的污染，所以在實(shí)驗(yàn)階段,，可以取空白樣本,，和陽(yáng)性樣本ST做對(duì)照，數(shù)據(jù)分析時(shí)可以用來(lái)純化樣本,，排除來(lái)自環(huán)境的干擾序列,。

?組間差異分析需重復(fù)取樣

要做組間差異分析時(shí)，每組要重復(fù)取樣,，才能做組與組之間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),。理論上，每個(gè)組至少3個(gè)樣就滿足基本的統(tǒng)計(jì)差異分析需求,。所以在重復(fù)取樣時(shí),，每個(gè)分組至少取3個(gè)樣。取樣時(shí)要保證每個(gè)分組內(nèi)部的樣本一致性,，如果組內(nèi)樣本之間的個(gè)體差異性較大,，則會(huì)影響后期組間差異結(jié)果分析。

?舉個(gè)例子

又例如在該圖中，TA200組中的TA3樣本的Anaeroplasmatales物種豐度含量非常高，該樣本與組內(nèi)的其他樣本明顯差異較大,，該樣本可能受到環(huán)境污染等其他因素干擾,，這樣就沒有辦法保證組內(nèi)樣本的均一性，也會(huì)影響分組之間的差異分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果,，再后期分析的時(shí)候建議把該樣本去掉重新分析,。

為了便于后期數(shù)據(jù)整理修改，每個(gè)分組需要保留一定量的重復(fù)樣本,，假如每個(gè)分組只取了3次重復(fù),，假如其中有一個(gè)樣本質(zhì)量不好需要去除，該分組只剩2個(gè)樣本,，則不滿足每組至少3個(gè)樣的分組條件，整體就沒有辦法做組間差異分析統(tǒng)計(jì),。

所以這里建議每個(gè)分組至少取5個(gè)樣做重復(fù),，一般6到10個(gè)樣就能分析出比較完善的結(jié)果。具體分組和組內(nèi)的重復(fù)取樣數(shù)量視具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案而定,。

在經(jīng)費(fèi)允許的情況下,，建議多取一些重復(fù)。假設(shè)每組取50到100個(gè)重復(fù)或者以上,，得到的分析結(jié)果就基本可以涵蓋該分組情況所有的菌群構(gòu)成情況,，可以較為全面的研究分組之間的菌群構(gòu)成差異情況。

當(dāng)拿到16S科研分析報(bào)告以后,，面對(duì)紛繁復(fù)雜,，各式各樣的圖表分析結(jié)果犯了難，不知道如何從這么多的圖表中入手,，快速找到報(bào)告中需要的圖表結(jié)果,。

這里對(duì)16S科研分析結(jié)果抽絲剝繭，概括出報(bào)告中的主要幾大內(nèi)容板塊,。

·16S科研分析究竟是在做什么,？

16S rDNA 是一種對(duì)特定環(huán)境樣品中所有的細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序，以研究環(huán)境樣品中微生物群體的組成,，解讀微生物群體的多樣性,、豐富度及群體結(jié)構(gòu)，探究微生物與環(huán)境或宿主之間的關(guān)系的技術(shù),。

主要是對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過(guò)濾得到的優(yōu)化序列,，降噪方法得到ASV，再對(duì)ASV進(jìn)行物種注釋,，注釋到門,、綱、目、科,、屬,、種各層次上的分類結(jié)果。

通過(guò)ASV表計(jì)算Alpha多樣性,，樣本內(nèi)的多樣性指數(shù),，Beta多樣性，樣本間相似性的指標(biāo),。

對(duì)ASV表進(jìn)行功能預(yù)測(cè),，例如Picrust2功能預(yù)測(cè)分析、Bugbase菌群表型特征分析,，F(xiàn)APROTAX生態(tài)功能預(yù)測(cè)等,。

得到的每個(gè)樣的數(shù)據(jù)結(jié)果，根據(jù)客戶提供的分組情況和理化指標(biāo),，進(jìn)一步做組間差異分析,，以及和環(huán)境理化指標(biāo)之間做關(guān)聯(lián)分析，相關(guān)性分析,，比較分組之間是否有差異,，差異是否顯著，來(lái)驗(yàn)證分組是否合理,，和環(huán)境宿主之間是否有關(guān)聯(lián)性,。

原始數(shù)據(jù)處理

Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序得到的雙端數(shù)據(jù)Raw PE，經(jīng)過(guò)拼接和質(zhì)控,，根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù),、接頭或PCR錯(cuò)誤，得到Raw Tags,。再經(jīng)過(guò)去重復(fù)序列,，去singleton序列，過(guò)濾嵌合體,，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù) Effective Tags,。

OTU（ASV） 表生成

微生物多樣性分析中最重要的就是OTU特征表，一切后續(xù)分析都圍繞OTU表來(lái)進(jìn)行,。生成OTU除了傳統(tǒng)的聚類的方法（一般按照97%的相似度進(jìn)行聚類）,，現(xiàn)在最新用到的技術(shù)的是降噪的方法得到ASV。

簡(jiǎn)單來(lái)講ASV就是在去除了錯(cuò)誤序列之后,，將Identity的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為100%進(jìn)行聚類,，常見的有DADA2、Deblur,、Unoise三種降噪方法,。項(xiàng)目里用到的是UNOISE2降噪方法獲得ASV數(shù)據(jù)。

物種的分類與注釋

采用QIIME2訓(xùn)練分類器方法對(duì)ASVs代表序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，默認(rèn)選用SILVA138數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋,。并在各個(gè)分類水平上：domain（域）,，phylum（門），class（綱）,，order （目）,，family（科），genus（屬）,，species（種）對(duì)每個(gè)樣本的群落組成統(tǒng)計(jì),。

alpha多樣性

Alpha多樣性主要反映樣本內(nèi)多樣性。對(duì)ASV表進(jìn)行計(jì)算可以獲得每個(gè)樣本的simpson,，ace,，shannon，chao1以及goods_coverage等指數(shù),，alpha多樣性指數(shù)用來(lái)來(lái)評(píng)估樣本菌群物種的豐富度（richness）和多樣性（diversity）

beta多樣性

Beta多樣性反映的是樣本間多樣性,，Beta多樣性是衡量個(gè)體間微生物組成相似性的一個(gè)指標(biāo)。通過(guò)計(jì)算樣本間距離可以獲得β多樣性矩陣,，基于OTU的群落比較方法報(bào)告中給出了，歐式距離,、bray curtis距離,、Unweighted UniFrac距離和Weighted UniFrac距離等。

功能預(yù)測(cè)

得到群落的微生物組成之后,，也可以對(duì)群落功能組成進(jìn)行預(yù)測(cè),，常用的16S功能預(yù)測(cè)的相關(guān)軟件有PICRUSt2、FAPROTAX,、BugBase,。

PICRUSt2用來(lái)預(yù)測(cè)功能，通常指的是基因家族,，PICRUSt2支持基于多個(gè)基因家族數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè),，報(bào)告中包括了KEGG同源基因，KO直系同源物,EC酶分類編號(hào),，MetaCyc途徑的豐度,，CAZy碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)，GMM是腸道代謝模塊和GBM是腸腦模塊,。

FAPROTAX是原核的微生物注釋代謝或其他生態(tài)相關(guān)的功能（例如硝化,，反硝化，發(fā)酵）的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件,。FAPROTAX預(yù)測(cè)的功能主要集中在海洋,、湖泊等環(huán)境樣本微生物的功能，特別是硫、碳,、氫,、氮的循環(huán)功能。

BugBase能進(jìn)行表型預(yù)測(cè),，其中表型類型包括革蘭氏陽(yáng)性（Gram Positive）,、革蘭氏陰性（Gram Negative）、生物膜形成（Biofilm Forming）,、致病性（Pathogenic）,、移動(dòng)元件（Mobile Element Containing）、氧需求（Oxygen Utilizing,，包括Aerobic,、Anaerobic、facultatively anaerobic）及氧化脅迫耐受（Oxidative Stress Tolerant）等7類,。

以上這些部分,，我們通過(guò)數(shù)據(jù)處理分析，得到了每個(gè)樣本相關(guān)的大量數(shù)據(jù)結(jié)果,，包括每個(gè)樣本的序列統(tǒng)計(jì),、ASVs表格、物種分類注釋統(tǒng)計(jì),、alpha多樣性指數(shù),、beta多樣性指數(shù)、功能預(yù)測(cè)等,。這些數(shù)據(jù)主要集中在報(bào)告里的這些內(nèi)容：

? 科研分析報(bào)告結(jié)果文件夾

01_pick_otu/  文件夾主要是對(duì)樣本ASV表格統(tǒng)計(jì)

02_sequence_statistic/ 文件夾是對(duì)樣本序列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

03_diversity-metrics / 文件夾是對(duì)樣本的alpha多樣性指數(shù),、beta多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)

04_Taxonomic/  文件夾是對(duì)物種分類注釋的統(tǒng)計(jì)（門到種水平）

Picurst2/  文件夾是Picrust2功能預(yù)測(cè)得到的每個(gè)樣本的相關(guān)功能預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)

Groups/  文件夾下是對(duì)組間差異分析結(jié)果

紅框是樣本個(gè)體的相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Group是分組比較

根據(jù)以上常規(guī)分析得到的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖,，其路徑也在對(duì)應(yīng)文件夾下,，可以打開 分析報(bào)告.html  有相關(guān)分析的圖表和對(duì)應(yīng)文件的詳細(xì)介紹和路徑說(shuō)明。

★拿到樣本后需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

當(dāng)我們拿到這些樣本大量的數(shù)據(jù)結(jié)果,，之后關(guān)鍵的一步就是做對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,，做統(tǒng)計(jì)分析，比較分組之間的差異結(jié)果,，找出菌群和環(huán)境之間的關(guān)聯(lián)性等,，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步做研究，找出課題方案對(duì)應(yīng)的結(jié)果,。

不同的數(shù)據(jù)用到的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法也不太一樣,，接下來(lái)我們對(duì)報(bào)告中的不同的分析結(jié)果對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)差異分析方法進(jìn)行介紹說(shuō)明。

? alpha多樣性

alpha多樣性指數(shù)組間差異統(tǒng)計(jì)分析用到的檢驗(yàn)方法是：?jiǎn)我蛩胤讲罘治觯ㄈ绻挥袃蓚€(gè)分組,，用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),，3個(gè)及以上的分組用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)）,，圖上方顯示P值

? beta多樣性

beta多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法有ANOSIM相似性分析和Adonis多元方差分析，這兩種都是基于距離矩陣的檢驗(yàn)方法,。

?Anosim相似性分析

Anosim分析是一種非參數(shù)檢驗(yàn),，用來(lái)檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義,。

報(bào)告中給出了加權(quán)距離和非加權(quán)距離的Anosim結(jié)果圖,，圖中給出了R值和P值。

R值用于比較不同組間是否存在差異,，R-value 介于（-1,，1）之間，R-value > 0,，說(shuō)明組間差異大于組內(nèi)差異,。R-value < 0，說(shuō)明組間差異小于組內(nèi)差異,。R只是組間是否有差異的數(shù)值表示,，并不提供顯著性說(shuō)明。

統(tǒng)計(jì)分析的可信度用 P-value 表示,，P< 0.05 表示統(tǒng)計(jì)具有顯著性,。

圖中能看出R>0，說(shuō)明組間差異大于組內(nèi)差異,，P<0.05 ,說(shuō)明差異顯著,，證明該分組情況效果較好。

?Adonis多元方差分析

Adonis多元方差分析,，其實(shí)就是PERMANOVA，亦可稱為非參數(shù)多元方差分析,。

其原理是利用距離矩陣（比如基于Bray-Curtis距離,、Euclidean距離）對(duì)總方差進(jìn)行分解，分析不同分組因素對(duì)樣品差異的解釋度,，并使用置換檢驗(yàn)對(duì)其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行顯著性分析,。

它與Anosim的用途相似，也能夠給出不同分組因素對(duì)樣品差異的解釋度（R值）與分組顯著性（P值）,。

報(bào)告中PCoA bray距離,、PCoA weighted_unifrac距離、PCoA unweighted_unifrac距離的圖片右下角有給出PERMANOVA檢驗(yàn)的P值和R值,。

圖中看出PCoa bray距離得到的檢驗(yàn)P<0.05 組間差異顯著,，并且分組之間區(qū)分較為明顯。

PCoa bray距離的PERMANOVA檢驗(yàn)結(jié)果路徑：

多組間檢驗(yàn)結(jié)果：Groups/betadiv/pcoa_bray_analysis/PERMANOVA.result_all.csv

在很多分析報(bào)告當(dāng)中,，例如在不同疾病的腸道菌群分組中,，本身樣本個(gè)體之間腸道菌群的物種多樣性,，豐富度差異并不大，alpha多樣性組間差異并不顯著,，beta多樣性分組間區(qū)分不是很明顯,，這樣就需要進(jìn)一步找出分組之間的差異物種或者差異功能來(lái)進(jìn)行分析。

對(duì)于不同分類水平的物種和功能預(yù)測(cè)結(jié)果用到以下幾種檢驗(yàn)方法：

Tukey主要應(yīng)用于3組或以上的多重比較,適合于各組例數(shù)相等的每?jī)蓛煞纸M之間比較,。

Tukey檢驗(yàn)的一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是非常簡(jiǎn)單,，而且所需實(shí)驗(yàn)樣本相對(duì)較少。

其檢驗(yàn)結(jié)果的可信度達(dá)到95%的置信水平時(shí),，最少的情況下只需6個(gè)樣本進(jìn)行驗(yàn)證（改善前3個(gè)樣本,、改善后3個(gè)樣本）。

·舉個(gè)例子

圖中的字母代表顯著性差異的字母表示法,，只要含有相同的字母,，就表明兩組之間沒有顯著性差異。

例如a和ab含有相同字母“a”,，表示兩組之間沒有顯著性差異,。ab中的“b”表示這一組和其他含有字母b的組（比如bc）沒有顯著性差異，但是a和bc就有顯著性差異了,。

圖中只展示Tukey檢驗(yàn)差異顯著的物種或功能,，如果數(shù)量較多，則只展示前10個(gè),。

路徑：Groups/diff_analysis/TukeyHSD/

圖中顯示的都是Tukey檢驗(yàn)組間差異顯著的物種,，依次按照豐度從高到底排列，如果差異結(jié)果較大,，則顯示前10個(gè)物種,。例如在該圖中，Tukey檢驗(yàn)結(jié)果,，門水平物種Actinobacteriota在BB與MG1組,、BB與MG2、BF與GG組,、BF與MG1組,、BF與MG2組，這些分組之間組間差異顯著,。

組間差異箱型圖用到的檢驗(yàn)方法是通過(guò)單因素方差檢驗(yàn)（只有兩個(gè)分組,，用的是Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，3個(gè)及以上的分組用的是Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)）,，Var檢驗(yàn)和one-way相結(jié)合,，篩選出組間差異性物種。

路徑：Groups/diff_analysis/TaxaMarkers

圖中每一個(gè)箱型圖代表一個(gè)組間差異顯著的物種

圖中顯示的都是統(tǒng)計(jì)方法得到的差異顯著的物種,，圖中能看出這3個(gè)物種分組之間差異顯著,。

命名格式是,，例如：Cen_Nitrosopumilus 指的是，當(dāng)前分類水平（屬水平）的名字 g__Nitrosopu 加上一級(jí)分類水平（科水平）的名字 f__Cenarchaeaceae 的前 3 個(gè)字母簡(jiǎn)寫Cen,，如果當(dāng)前水平?jīng)]有注釋到名字則以全稱的名字表示,。

例如這是一個(gè)表格的截圖

紅框  mean_  是分組組間的平均值

藍(lán)框  sd_  代表組間的標(biāo)準(zhǔn)差

粉色  .test  代表不同統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果的P-value P值，這里有var檢驗(yàn) T 檢驗(yàn) Wilcoxon檢驗(yàn)(或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn))

綠色  _BH   例如Wilcoxon.test_BH代表Wilcoxon.test檢驗(yàn)BH矯正的Q-value,，Q值

單因素方差分析是指如果只有兩個(gè)分組,，用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，3個(gè)及以上的分組用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn),。

路徑：Groups/diff_analysis/UnivarTestXXX

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表：Groups/diff_analysis/UnivarTestXXX/ UnivarTest_sign.txt

·舉個(gè)例子

圖中顯示的是該統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)差異顯著的物種的柱狀圖或箱型圖,，按照豐度從高到低排列，如果差異物種/功能較大,，則只顯示前10個(gè),。例如該圖中Therobifida、Staphylococcus,、Streptomyces等物種用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)得到的組間顯著差異物種,。

該圖展示了Bacillus物種Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)差異結(jié)果，所有分組中P<0,001  多組間差異顯著,，兩組間BB與GG,、BB與MG1、BB與MG2,、BF與GG,、BF與MG1、BF與MG2,，組間差異顯著。

LEfse分析即LDA Effect Size分析,，是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識(shí)（基因,、通路和分類單元等）的分析工具，可以進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)分組的比較,，它強(qiáng)調(diào)統(tǒng)計(jì)意義和生物相關(guān)性,，能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)（Biomarker）。

LEfSe用到的統(tǒng)計(jì)分析方法是將線性判別分析與非參數(shù)的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)相結(jié)合,。

LEfse分析結(jié)果中一般會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)圖,，一張表（ LDA值分布柱狀圖,、進(jìn)化分支圖以及特征表）。

LDA值分布柱狀圖

這個(gè)條形圖主要為我們展示了LDA score大于預(yù)設(shè)值的顯著差異物種,，即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomaker,，默認(rèn)值為2.0（看橫坐標(biāo)，只有LDA值的絕對(duì)值大于2才會(huì)顯示在圖中）,；柱狀圖的顏色代表各自的分組,，長(zhǎng)短代表的是LDA score，即不同組間顯著差異物種的影響程度,。

路徑：

Group/Lefse_Analysis/out_formant.cladogram.png

圖中展示了不同分組特有的Lefse組間差異標(biāo)記物,，例如BB組的標(biāo)記物是目水平的Bacillales和科水平的Bacillaceae,不同的分組標(biāo)記物也不同，圖中如果只展示了部分分組,，則代表只有部分分組通過(guò)Lefse分析篩選出組間差異標(biāo)記物,。

進(jìn)化分支圖

小圓圈： 圖中由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級(jí)別（最里面的那個(gè)黃圈圈是界）。不同分類級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類,，小圓圈的直徑大小代表了相對(duì)豐度的大小,。

顏色： 無(wú)顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異顯著的物種Biomarker跟隨組別進(jìn)行著色,，紅色節(jié)點(diǎn)表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群,，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示在藍(lán)色組別中起到重要作用的微生物類群。

未能在圖中顯示的Biomarker對(duì)應(yīng)的物種名會(huì)展示在右側(cè),，字母編號(hào)與圖中對(duì)應(yīng)（為了美觀,，右側(cè)默認(rèn)只顯示門到科的差異物種）。

路徑：Group/Lefse_Analysis/out_formant.png

圖中右側(cè)展示了分支圖中的字母對(duì)應(yīng)的物種信息,，例如a 代表GG組的標(biāo)記物目水平的Microtrichales ,，b代表GG組的標(biāo)記物剛水平的Acidimicrobiia。在分支圖的最外層顯示的是各分組門水平物種的標(biāo)記物,，例如BF組的是Actinobacteriota,、MG1組的是Proteobacteria、

MG2組的是Cyanobacteria

特征表

第一列是樣本中從門到屬水平所有分類單位的列表

Lefse會(huì)逐一判斷這些分類單位的在分組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異,。

第二列：各組分豐度平均值中最大值的log10,，如果平均豐度小于10的按照10來(lái)計(jì)算；如果該分類單位未體現(xiàn)出顯著組間差異,，則后三列為空,。

對(duì)于具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的分類單位：

第三列：差異基因或物種富集平均豐度最高的分組組名；

第四列：LDA差異分析的對(duì)數(shù)得分值,；

第五列：Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)的p值,，若不是Biomarker用“-”表示。

默認(rèn)LDA>2,，P<0.05

通常根據(jù)第4列的LDA差異分析對(duì)數(shù)得分值和第五列的P值,，可以描述組間具有顯著差異的分類單位統(tǒng)計(jì)學(xué)效力強(qiáng)弱,。

metagenomeSeq是用R開發(fā)的一個(gè)包，metagenomeSeq的基本思想,，用normalization實(shí)現(xiàn)分類注釋時(shí)的biases處理,，同時(shí)用零膨脹高斯分布（zero-flated Gaussian distribution）處理了測(cè)序深度所帶來(lái)的影響，在此基礎(chǔ)上,，利用線性模型找到存在的差異所在,。

路徑：Groups/diff_analysis/ metagenomeRXXX

圖中顏色越深相關(guān)性越小，顏色越接近黃色相關(guān)性越大,，從圖中能看出Actinobacteria物種與BB組和BF組相關(guān)性較大,。

圖中紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān),，顏色越深,，圓圈越大，相關(guān)性也越大,，例如圖中能看出MGB049余MF0025 之間成正相關(guān),，且相關(guān)性較大。

一種非線性分類器,，隨機(jī)森林屬于集成類型的機(jī)器學(xué)習(xí)算法,，挖掘變量之間復(fù)雜的非線性的相互依賴關(guān)系。通過(guò)隨機(jī)森林重要性點(diǎn)圖,，可以找出分組間差異的關(guān)鍵物種/功能,。

反映了分類器中對(duì)分類效果起主要作用的特征，按重要性從大到小排列,。

Error rate：表示使用下方的特征進(jìn)行隨機(jī)森林方法預(yù)測(cè)分類的錯(cuò)誤率,，數(shù)值越高表示基于特征分類準(zhǔn)確度不高，可能分組之間特征不明顯,。分值越低證明分組效果比較好,。

·舉個(gè)例子

圖中按照隨機(jī)森林模型效果篩選出的對(duì)分組效果有重要性作用的物種，按照重要性從高到低進(jìn)行排列,，例如圖中最終要的是a,依次往下是b,、c等。錯(cuò)誤率較小,，表明該分組效果較好,。

ROC曲線分析是一種常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，在醫(yī)學(xué)研究中主要用于評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的效能,。在16S測(cè)序報(bào)告中，我們通過(guò)繪制ROC曲線,，并計(jì)算ROC曲線下面積（AUC）,，來(lái)確定分組對(duì)于菌群是否有診斷價(jià)值,。

ROC曲線圖是反映敏感性與特異性之間關(guān)系的曲線。ROC曲線下的面積值在1.0和0.5之間,。在 AUC>0.5的情況下,，AUC越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好,。

AUC在0.5~0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性,，AUC在0.7~0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性,。AUC=0.5時(shí),，說(shuō)明診斷方法完全不起作用，無(wú)診斷價(jià)值,。AUC<0.5不符合真實(shí)情況,，在實(shí)際中極少出現(xiàn)。

·舉個(gè)例子

從圖中能看出各分組的AUC都大于大于0.9,，各分組的分組效果較好,，BF組AUC等于1，該分組效果最好,，可能樣本之間較為相近,，并且跟其他分組組間差異也比較大。

以上是組間統(tǒng)計(jì)差異的方法介紹,，其他的還包括關(guān)聯(lián)分析,。

例如客戶提供了每個(gè)樣的相關(guān)理化指標(biāo)數(shù)據(jù)，想計(jì)算這些指標(biāo)與均屬之間有什么相關(guān)性,，就可以做一下分析,。

?相關(guān)性熱圖

例如從該圖中能看出6與n物種成正相關(guān)，并且相關(guān)性極顯著**,，7與b物種成負(fù)相關(guān),，并且相關(guān)性極顯著**。

?CCA圖

可以分析樣本,、菌群,、理化指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。圖中使用點(diǎn)代表不同的樣本，從原點(diǎn)發(fā)出的箭頭代表不同的環(huán)境因子,。

箭頭的長(zhǎng)度越長(zhǎng),，表示環(huán)境因子的影響越大；夾角越小,，代表相關(guān)性越高,。樣本點(diǎn)與箭頭距離越近，該環(huán)境因子對(duì)樣本的作用越強(qiáng),。

圖像中坐標(biāo)軸標(biāo)簽中的數(shù)值,，代表了坐標(biāo)軸所代表的環(huán)境因子組合對(duì)物種群落變化的解釋比例。

例如從圖中能看出pH ,、NO2N,、02與 Acinetobacter、Weissella等物種成正相關(guān),，與T3D0,、T1D0、T4D0等D0組的樣本成正相關(guān),。

?RDA 冗余分析

例如從圖中能看出pH與Helicobacer物種成正相關(guān),，相關(guān)性較大，pH與NC組有一定的相關(guān)性,。

?Envfit分析

圖中能看出ASD與正常兒童之間的分組與菌群之間相關(guān)性極顯著**,，其次是否有先兆流產(chǎn)的分組與菌群之間有顯著相關(guān)性*，其他的包括是否喝牛奶,、孕期是否感染,、妊娠高血壓都與菌群有相關(guān)性。

圖中能看出pH 與Candidatus Rhabdochlamydia 之間成正相關(guān),，且相關(guān)性顯著，pH 與Sinorhizobium,、Euzebya 之間成負(fù)相關(guān),，切相關(guān)性顯著。

?Network網(wǎng)絡(luò)分析

還可以做菌屬之間的網(wǎng)絡(luò)分析關(guān)聯(lián)圖,，共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖為研究復(fù)雜微生物環(huán)境的群落結(jié)構(gòu)和功能提供了新的視角,。

由于不同環(huán)境下微生物的共發(fā)生關(guān)系截然不同，通過(guò)物種共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖,，可以直觀看出不同環(huán)境因素對(duì)微生物適應(yīng)性的影響,，以及某個(gè)環(huán)境下占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)物種,、互作緊密的物種群，這些優(yōu)勢(shì)物種以及物種群往往對(duì)維持該環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定發(fā)揮著獨(dú)特以及重要的作用,。

·舉個(gè)例子

這兩個(gè)圖類似的物種相關(guān)性的圖,，用同一個(gè)數(shù)據(jù)做出來(lái)的,，圖中能看出Bacillales、Desulfovibrionales,、Selenomonadales與其他物種相關(guān)性較強(qiáng),。

報(bào)告中已經(jīng)基本都涵蓋了16S科研數(shù)據(jù)分析所需要的圖表、差異統(tǒng)計(jì),，以及相關(guān)性分析結(jié)果,。如果在幾種不同類型的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)比之下有略微的差異結(jié)果，選取其中一組差異結(jié)果即可,。

報(bào)告里涵蓋了大部分16S所需要的圖片,，不過(guò)也有個(gè)別個(gè)性化的圖需要單獨(dú)用到軟件去做，可以單獨(dú)完成個(gè)性化圖表生成,。

隨著16s分析報(bào)告的不斷升級(jí),，報(bào)告中的圖表以及相應(yīng)的解讀也會(huì)越來(lái)越精細(xì)完善，谷禾也將盡可能為大家的科研之路帶來(lái)更多便利,。