軟件簡介

在微生態(tài)研究中,，當(dāng)我們做完多樣性測序后，想找出不同處理組之間差異物種或差異基因,，一般常用的組間差異分析metastats（只能用于兩組之間的差異比較）、LEfSe以及STAMP等,。

今天給大家介紹STAMP的安裝及使用：

該軟件2014年發(fā)表于Bioinformatics,，目前已被引用313次。該軟件非常強(qiáng)大,，不僅能夠?qū)山M甚至多組樣本在任何分類水平的物種等進(jìn)行顯著性差異分析,，而且該軟件的操作簡單易學(xué)。

1. 準(zhǔn)備輸入文件

在應(yīng)用之前,，首先要整理STAMP文件,，格式如下圖。如果關(guān)心的是不同分類單元差異物種,，那么前面幾列是物種的分類單元等級(jí),，如果有4個(gè)等級(jí)（例如目，科，屬,，種）,，那么前面就有4列（Hierachical level列）。接著后面就是每個(gè)樣品的OTU數(shù)目信息,。

文件格式的整理是個(gè)關(guān)鍵步驟,。STAMP有兩種輸入文件方式：

1.自己整理的STAMP格式文件；并且另存為.spf 格式,。

2.轉(zhuǎn)換Mothur,、Picrust等軟件生成的其他格式文件為STAMP格式文件。

下面將介紹第一種自己整理的STAMP格式文件的方法：

OTU豐度文件,，每列之間用tab鍵隔開的.spf文件（可在excel表格內(nèi)編輯,，然后保存為spf格式文件，需要注意的是該文件一定要包含表頭）

 由于在同一個(gè)表格中選擇不同level 的功能經(jīng)常出現(xiàn)Bug,，所以我們推薦讀者把不同的分類單元分別保存成*.spf文件,。

如圖所示我們按目，科,，屬,，種不同的分類等級(jí)分別保存成.spf的文件，然后在分析的時(shí)候各自單獨(dú)運(yùn)行,。

接著我們還需要準(zhǔn)備一個(gè)分組信息meta文件（格式同豐度表格式,，該文件也需要加入表頭，否則會(huì)默認(rèn)第一行為表頭,，導(dǎo)致樣本缺失,。）如下圖：

準(zhǔn)備好以上文件之后我們就可以開始了

2. 文件導(dǎo)入

打開軟件后，點(diǎn)擊左上角的“file”-“l(fā)oad data”,，輸入文件即可,。(方法File-load data，選擇文件導(dǎo)入,，注意文件存放的路徑中不能包含中文字符)

3. 數(shù)據(jù)比較與作圖

文件導(dǎo)入成功后,，就可以設(shè)置參數(shù)，繪制想要的圖了,。具體的參數(shù)設(shè)置見下圖：

該軟件默認(rèn)打開界面Multiple groups（多組比較）,，根據(jù)實(shí)際需要的比較方案進(jìn)行選擇，比如想進(jìn)行兩組之間的比較,，首先點(diǎn)擊Two groups,，然后選擇需要比較兩組的組名以及統(tǒng)計(jì)方法和過濾條件，即可進(jìn)行顯著性差異統(tǒng)計(jì)分析,。

一般常用的多組分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括ANOVA和Kruskal-Wallis H-test,。兩組之間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括t-test(equalvariance),，Welch’s t-test和White’snon-parametric t-test。為了確保統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和結(jié)果的準(zhǔn)確度,，需要選擇合適的檢驗(yàn)方法,。t-test檢驗(yàn)可以在最少樣本數(shù)為4的時(shí)候保持較高的準(zhǔn)確度和精確度，而且當(dāng)兩個(gè)分組之間具有相同的方差時(shí),，用t-test也更為準(zhǔn)確,。

當(dāng)方差不同時(shí)，Welch’s t-test更為準(zhǔn)確,。White’s non-parametrict-test算法計(jì)算時(shí)間較長,，當(dāng)樣本數(shù)目少于8的時(shí)候，可以使用該檢驗(yàn)方法,，當(dāng)樣本數(shù)目過多時(shí),，不宜使用該檢驗(yàn)方法。

4. 作圖類型及導(dǎo)出

結(jié)果示例：

注意事項(xiàng)

1.     結(jié)果文件存放路徑中不能存在中文字符,，否則在數(shù)據(jù)無法導(dǎo)入到軟件,。

2.     當(dāng)輸入的豐度表文件和分組文件樣本不一致時(shí)，remain Unclassiffied reads和use only forcalculating frequency profiles方法會(huì)保留所有的數(shù)據(jù),，而remove Unclassiffied reads僅僅保留有確定分組信息的數(shù)據(jù),。注意的是，分組文件的樣本一定在豐度表文件中存在,，否則會(huì)報(bào)錯(cuò),，反之，是可以的,。

3.目前版本的STAMP存在一些小的bug,，一次分析只能使用一個(gè)數(shù)據(jù)文件，如果要打開新的數(shù)據(jù)文件,，需要關(guān)閉軟件后重新打開,。如果分析完成，一定要記得保存（可以存為PDF格式或圖片格式）,，不然需要再重新分析一次,。

測試數(shù)據(jù)下載鏈接：http://pan.baidu.com/s/1hrHRhAG，提取碼：v64x

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