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摘要

花色是影響觀賞花卉商業(yè)價值的決定性因素。因此,，研究百合花色形成的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)調(diào)控這一重要性狀的因素具有重要意義。本研究對 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 (TFs) 進行了表征,，以了解百合花青素生物合成的調(diào)控機制,。發(fā)現(xiàn)兩個 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 LvMYB5 和 LvMYB1 可調(diào)節(jié)百合花中的花青素生物合成。具有激活基序的 LvMYB5 屬于擬南芥SG6 MYB 蛋白亞群,。LvMYB5的瞬時表達表明 LvMYB5 可以促進本氏煙葉片的著色,，而LvMYB5的表達可以增加NbCHS、NbDFR和NbANS的表達水平,。在百合花瓣中進行的 VIGS 實驗表明,，當LvMYB5沉默時，花青素的積累會減少,。螢光素酶測定表明 LvMYB5 可通過激活ANS促進花青素合成基因啟動子,。因此，LvMYB5在百合花色中起著重要作用,。此外,，瞬時表達實驗提供了 LvMYB1（一種 R2R3-MYB TF）抑制百合花中花青素合成的初步證據(jù)。百合花色苷生物合成相關激活和抑制因子的發(fā)現(xiàn),，為通過基因工程改善花色提供了理論依據(jù),。我們的研究結(jié)果為進一步研究百合花色形成機制提供了新的方向。

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技術路線

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主要結(jié)果

3.1 花青素積累與百合花瓣中的基因表達有關

為了測量百合花瓣發(fā)育過程中的顏色變化,，我們測量了花蕾期（S1）,、著色期（S2）和盛花期（S3）花瓣中的花青素含量。S1階段的花瓣是無色的,。S2期花瓣部分著色,，S3期花全開，花瓣完全著色,。在三個階段的每一個階段都從花瓣中提取總花青素,。結(jié)果表明，與其他兩個樣品相比,，S1 花瓣的花青素含量極低（圖 1A,、B）。S2期花瓣花青素積累明顯,，S3期花瓣花青素含量最高（圖1A,、B）。因此,，花青素及其成分在百合花發(fā)育過程中逐漸積累,。

為了分析與百合花色相關的基因，分離并克隆了兩個調(diào)控基因LvMYB1和LvMYB5 ,。qRT-PCR 分析用于量化花發(fā)育過程中的基因表達,。我們發(fā)現(xiàn),，在S2和S3階段，LvMYB5的表達上調(diào)（圖1C）,，這與花青素積累的趨勢相似（圖1B）,。LvMYB1的表達在 S1 階段最高，在 S2 和 S3 階段顯著下調(diào)（圖 1D）,。因此,，LvMYB5和LvMYB1在花瓣顏色發(fā)展過程中表現(xiàn)出對比鮮明的表達模式。這些結(jié)果表明,，兩種 MYB TFs 都在花青素積累過程中表達,，但它們的表達模式非常不同。因此,，它們可能對花青素合成和/或積累產(chǎn)生相反的影響,。

3.2 轉(zhuǎn)錄因子LvMYB5和LvMYB1的功能分析

為了探索百合花瓣色素沉著過程中的基因表達，我們克隆了LvMYB5和LvMYB1基因,。全長 cDNA 的長度分別為 720 和 630 bp,。兩種 cDNA 都包含一個完整的開放閱讀框。亞細胞定位實驗表明,，LvMYB1和LvMYB5蛋白定位于細胞核,，為核蛋白（圖2）。

我們接下來對來自LvMYB1,、LvMYB5和來自擬南芥的 MYB 基因家族蛋白的預測蛋白質(zhì)序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 3A）,。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示 LvMYB5 是來自擬南芥MYB TF SG6 亞群的包含 AtMYB75、AtMYB90,、AtMYB113 和 AtMYB114 的進化枝的成員,。因此，LvMYB5 可能與這些作為植物著色激活劑的蛋白質(zhì)具有相似的功能,。此外,，LvMYB1 與擬南芥SG4 亞群中的 AtMYB3、AtMYB7 和 AtMYB32 分組,。MYB 家族 TFs 和 LvMYB1 在抑制花青素合成方面可能具有相似的功能,。因此，我們初步證實 LvMYB5 和 LvMYB1 在進化上與其他調(diào)節(jié)花青素生物合成的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子密切相關,。

使用 LvMYB5 和 LvMYB1 的蛋白質(zhì)序列與來自其他植物的花青素合成相關的 MYB TF 構建多序列比對（圖 3B）,。發(fā)現(xiàn) LvMYB5 類似于來自許多植物的激活劑型 MYB TF，例如 MaAN2,、SIMYB75,、AtMYB75 和 MdMYB1，它們包含共同的保守 R2/R3 結(jié)構域和激活基序,。此外,，與 bHLH 蛋白相互作用的 R3 結(jié)構域中 [D/E]Lx2[K/R]x3Lx6Lx3R 基序中的六個必需氨基酸也是保守的,。因此，LvMYB5 可作為激活劑 MYB TF 促進百合花中花青素的生物合成,。

3.3 LvMYB5和LvMYB1分別促進和抑制本氏煙草葉片中花青素的積累

在瞬時表達實驗中驗證了LvMYB5和LvMYB1在花青素生物合成中的功能,。將 35S：pGreenII（空載體）,、35S：LvMYB5和 35S：LvMYB1 + 35S：LvMYB5構建體農(nóng)桿菌浸潤到本氏煙草的葉子中,。我們發(fā)現(xiàn)空載體陰性對照不促進葉片的著色。然而,，在被 35S: LvMYB5浸潤的葉表皮細胞中,，花青素顯著積累（圖 4A）。此外,，本氏煙草中沒有明顯的花青素積累,。葉與 35S：LvMYB1 + 35S：LvMYB5（圖 4A）和 35S：LvMYB1共浸潤，結(jié)構基因的相對表達降低（補充圖 2）,。因此,，我們的研究結(jié)果表明LvMYB1和LvMYB5對百合花瓣著色具有相反的影響。LvMYB5促進著色,，而LvMYB1抑制花青素積累,。

從浸潤的本氏煙草葉片中提取花青素，發(fā)現(xiàn)陰性對照葉片中不存在明顯的色素,。用 35S：LvMYB1和 35S ：LvMYB5構建體浸潤的本氏煙草葉片含有非常少的花青素（圖 4B）,。花青素濃度測定結(jié)果還表明,，35S :LvMYB5 浸潤的葉片總花青素含量較高,，而35S : LvMYB1和35S :LvMYB5浸潤葉片的總花青素含量顯著降低。（圖4C）,。

我們通過 qRT-PCR 進一步驗證了本氏煙草葉片中的基因表達（圖 4D）,。我們發(fā)現(xiàn)，當 LvMYB5 過表達或與LvMYB1載體一起過表達時,， LvMYB5的表達沒有顯著差異,。這表明LvMYB1不抑制LvMYB5的表達。對本氏煙葉片結(jié)構基因表達水平的分析表明,，與陰性對照相比,，LvMYB5的瞬時過表達導致NbCHS 、NbDFR和NbANS的表達不同程度地上調(diào),。當LvMYB5和LvMYB1同時過表達,，本氏煙中NbCHS、NbDFR和NbANS的表達下調(diào),。因此,，LvMYB5是花青素生物合成的激活劑,。相反，LvMYB1可能會抑制花青素生物合成途徑中基因的表達,。

3.4 LvMYB5和LvMYB1分別促進和抑制百合花瓣中花青素的積累

進行瞬時過表達實驗以研究LvMYB1和LvMYB5對百合花瓣著色的作用,。含有 35S：pGreenII（空載體）、35S：LvMYB5 和 35S：LvMYB1 的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物用于侵染百合芽的外花瓣,，這些花瓣是綠色的,，剛剛開始著色（補充圖 3）。一周后,，我們發(fā)現(xiàn)被空載體培養(yǎng)物浸潤的花瓣由于受到細菌感染的影響而略有變色,。然而，與空載體對照花瓣相比,，過度表達 35S :LvMYB5的百合花瓣顏色更深（圖 5A), 并具有較高的花青素水平 (圖 5B,C ),。此外，過表達35S :LvMYB1的百合花瓣出現(xiàn)明顯的褪色（圖5A）,，花青素積累也明顯減少（圖5B,、C）。這些結(jié)果進一步表明LvMYB5可以促進花青素積累,，而LvMYB1可以抑制花青素積累,。

3.5 沉默LvMYB5基因會抑制百合花瓣中的花青素合成

為了進一步分析LvMYB5激活劑在百合花瓣花青素生物合成中的作用，將LvMYB5基因的330 bp DNA片段克隆到pTRV2載體中進行VIGS（病毒誘導基因沉默）,。結(jié)果表明,，感染空TRV載體的百合花瓣顏色無明顯影響，而感染pTRV2 -LvMYB5載體的百合花瓣顏色在感染后變白,。LvMYB5基因被沉默（圖6A）,。花青素提取和定量表明,，在感染了 pTRV2 -LvMYB5的花瓣區(qū)域中,，花青素的量顯著降低（圖 6B，C）,。對感染pTRV1和pTRV2 -LvMYB5載體的百合花瓣基因表達水平分析表明,，與陰性對照相比，其引起LvMYB5,、LvCHS,、LvDFR和LvANS表達不同程度的下調(diào)，而LvMYB1的表達沒有受到顯著影響（圖 6D）,。當LvMYB5被沉默時,，百合花瓣中花青素的積累嚴重減少。因此,，LvMYB5的沉默可以通過下調(diào)花青素生物合成途徑中結(jié)構基因的表達來影響百合花瓣的色素沉著,。我們得出結(jié)論,，LvMYB5在百合花瓣著色中具有重要作用。

3.6 LvMYB5轉(zhuǎn)錄因子與花青素合酶啟動子的結(jié)合

通過分析 1500 bp 百合ANS基因啟動子（ANSp） 序列中的順式作用元件,，我們發(fā)現(xiàn)在 ANS 基因啟動子區(qū)域存在多個 MYB 結(jié)合位點（圖 7C）,。為了研究 ANSp 中的主要 MYB 結(jié)合位點，我們構建了 ANSp DNA 片段被截短的表達載體,?；贛YB結(jié)合位點分析，我們構建了三個含有截短ANS啟動子片段的載體：ANSp1,、ANSp2和ANSp3 DNA片段的長度分別為1,200,、900和300 bp（圖7C）。用截短的 ANSp 片段進行的激活實驗表明 pGreenII 62-SK + ANSp2-Luc 和 35S 之間的活性沒有顯著差異：LvMYB5+ ANSp2-Luc 治療。類似地,，35S：LvMYB5 + ANSp3-Luc 和 pGreenII 62-SK + ANSp3-Luc 處理之間沒有顯著差異（圖 7D）,。因此，ANSp2 和 ANSp3 中的 MYB 結(jié)合位點在 LvMYB5 激活 ANS 基因啟動子中不起主要作用,。然而，熒光素酶活性在 35S：LvMYB5 + ANSp1-Luc 和 35S：LvMYB5之間也沒有顯著差異+ ANSp-Luc ，兩者都遠高于其他任何處理,。這些結(jié)果表明ANSp的–1,200至–900 bp區(qū)域的MYB結(jié)合位點可能是LvMYB5的主要結(jié)合位點；LvMYB5可以增加啟動子的活性,，誘導基因表達,，進而促進花瓣組織中花青素的合成。此外,，該區(qū)域的MYB TFs可以識別三個結(jié)合位點,；兩個 MYB 結(jié)合位點在 –1,061 bp 處部分重疊（在圖 7C中以紅色顯示），這可能會增強它們的效果,。因此,，這些很可能是結(jié)合 LvMYB5 以激活ANS基因轉(zhuǎn)錄的主要順式作用元件。

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結(jié)論

在本研究中,，編碼 MYB TF 的與百合花顏色形成有關的基因LvMYB1和LvMYB5 被克隆,，并對其功能進行了表征。這些基因編碼的蛋白質(zhì)的功能通過瞬時過表達,、病毒誘導的基因沉默 (VIGS),、雙熒光素酶測定和亞細胞定位來驗證。在本研究中,，我們分析了兩種不同 MYB 基因在百合花色素沉著中的調(diào)控作用,，以揭示在百合花顏色形成中起作用的分子調(diào)控機制。這將使我們更好地了解百合和其他觀賞植物花色的發(fā)育和調(diào)控,。

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獲取原文

原文鏈接：

https://www./articles/10.3389/fpls.2021.761668/full

END

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