Q：最新開發(fā)的Linked read測序方式對meta測序方面有改進(jìn)作用嗎？

A：不知道這里提到的Linked read是不是類似10x的技術(shù),，我暫時(shí)默認(rèn)是,。目前我們正在做用stLFR測擴(kuò)增子的開發(fā)項(xiàng)目，我們希望把核糖體RNA的全長測出來,，但是這中間存在算法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的挑戰(zhàn),，是可以做但是這條路還沒有最后走通，我們正在努力,。

Q：16S引物的覆蓋度是怎樣,？V3和V3-4那個(gè)好一些？

A：這個(gè)問題沒法回答,，這取決于經(jīng)驗(yàn),，比如人類腸道基因組計(jì)劃中，他們分別挑了分屬于不同種Staphylococus,，這兩個(gè)種在V4區(qū)是完全一樣的,，即在V4區(qū)是無法區(qū)分但是可以在V1區(qū)被分開，但是又不是所有菌在V4區(qū)都分不開，而實(shí)際上V4區(qū)是目前大家用的最多的區(qū)域,，不同的菌在不同區(qū)的分辨率是不同的,。如果你局限于單基因，那么就永遠(yuǎn)跳不出單基因給你的分辨率,，這也就是為什么我們最終還是會走向shotgun sequenncinf,，但是擴(kuò)增子由于單個(gè)樣本需要的通量小，它可以應(yīng)用于快檢或者用于測量百萬級別的樣品,。對于分辨率,，如果你focus在一個(gè)基因，就逃不過這個(gè)基因給你的分辨率,。

Q：實(shí)驗(yàn)部分,，如果16S或meta建庫條帶很散，散的部分沒割膠回收是不是多樣性會變低,？但是回收散的部分文庫檢測又不合格,。

A：實(shí)際上我們不割膠，只是為了驗(yàn)證條帶是否有跑出來,。不過這確實(shí)是一個(gè)問題,，比如做真菌ITS，會看到多個(gè)條帶,，這個(gè)條帶已經(jīng)超過了預(yù)測的長度,，我們不知道具體原因，但有可能是因?yàn)楹颂求wRNA在基因組中是連續(xù)重復(fù)的,，而且在真菌中是連續(xù)上千個(gè)重復(fù),，這就有可能導(dǎo)致更大片斷的擴(kuò)增子，但是目前還不確定是不是這樣的原因,，不過經(jīng)常遇到這樣的現(xiàn)象,。

Q：現(xiàn)在是否可以用人工智能的技術(shù)進(jìn)行基因組測序？

A：測序可能不太可能,，但是說到數(shù)據(jù)分析目前有一些工具,，但是效果并不能達(dá)到傳統(tǒng)工具的效果，我個(gè)人認(rèn)為是因?yàn)槲覀冎赖倪€太少,，我們已知的測序得到的基因組還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,，我們現(xiàn)在無法估計(jì)世界上有多少微生物。

Q：宏基因組是不是也需要和很多微生物的基因組去比對呢,？那比對的時(shí)候,，有沒有常用的微生物基因組呢？

A：我推薦大家去看一下2018年natrue那篇文章,，如果你做的是人類腸道樣本而不是土壤樣本,，你想知道最可靠最不可能被編輯拒稿的方法,，可以去看一下這個(gè)文章，它實(shí)際上是把測序的序列比對了最常見的蛋白數(shù)據(jù)庫,，比如KEGG等,，或特定功能的數(shù)據(jù)庫，比如抗生素基因,、和碳源代謝有關(guān)的基因等?，F(xiàn)在尤其是對土壤來說，宏基因組你想比較充分利用你的數(shù)據(jù)可能比對的方法會更有效,，但是目前很多公司都會把測序數(shù)據(jù)先組裝,，然后根據(jù)組裝的結(jié)果進(jìn)行解讀，而組裝利用到的數(shù)據(jù)不到10%,，不過這也取決你測序樣本的復(fù)雜性,。

Q：16sV4區(qū)是否有最新發(fā)表的通用引物？

A：目前有研究是通過搜索數(shù)據(jù)庫,，發(fā)布了一個(gè)V4區(qū)的改進(jìn)引物,，但是這個(gè)引物效果如何很難驗(yàn)證，所以目前大家常用的還是之前的引物,。

Q：病人的腸道菌群是可能因?yàn)槊刻斓娘嬍巢煌l(fā)生變化,，但是我們實(shí)際上是想要知道，因?yàn)槟撤N比較固定的膳食習(xí)慣,，人體腸道菌群可能會有一些固定的菌群在某種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,，如何區(qū)分這些因素對固定腸道菌群混雜？

A：這不是一個(gè)測序的問題,，是一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的問題,，怎樣通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)把飲食效果識別出來。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以減輕后續(xù)統(tǒng)計(jì)的難度,，或者通過示蹤,，但是這個(gè)我沒有做過,。

Q：如了解土壤微生物與植物土傳病害間關(guān)系,，該如何設(shè)計(jì)和取樣？

A：首先和土傳病害沒有關(guān)系,，還是在于你想回答的問題是什么,，是否有已知信息已經(jīng)知道某些微生物會抑制某些疾病，還是所有信息都未知,，希望通過實(shí)驗(yàn)得到一些重要信號,。我沒有辦法給大家一個(gè)具體建議，這個(gè)問題還是取決于你本身的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),。微生物測序只能給你多一層的數(shù)據(jù)（一個(gè)矩陣）,，怎么用這個(gè)矩陣是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的問題。

Q：我有兩組數(shù)據(jù)，做β多樣性pcoa得到pc1是95%,，pc2是2%,，但圖示顯示兩組樣本幾乎重疊，這樣的數(shù)據(jù)有意義嗎,？

A：這個(gè)取決于你如何解讀,，但是pc1為什么會那么高，是否考慮有outlier,。

Q：宏基因組測序的測序深度一般是多少呢,？

A：還是取決于你要回答的問題，但是有一點(diǎn),，宏基因組測序永遠(yuǎn)是淺的,，隨機(jī)的片段永遠(yuǎn)是非常淺的數(shù)據(jù)，你的coverage達(dá)不到1,，甚至達(dá)不到0.01,，不過這個(gè)是針對復(fù)雜樣品，比如土壤或者腸道,。

如何分析shotgun數(shù)據(jù),，目前沒有100%的定論，但是我們傾向于用基因組的方法來解決而不是組裝的方法,，我有shotgun的數(shù)據(jù),，有從頭組裝和比對兩個(gè)選擇，從頭組裝就是我不依賴數(shù)據(jù)庫,，把它拼回原始的“拼圖”,，但是因?yàn)楹昊蚪M數(shù)據(jù)沒有辦法得到完整的數(shù)據(jù)，即使我得到了一個(gè)較長的序列,，還是需要依賴數(shù)據(jù)庫對這些序列做注釋,，即還是無法繞開已知基因組。我們可以把這個(gè)問題分成兩個(gè)部分,，完善基因組是一些科學(xué)家的任務(wù),，而作為微生物生態(tài)學(xué)家我們沒有太多精力去詳細(xì)研究具體微生物，所以我們選擇相信目前的數(shù)據(jù)庫是可靠的,，如果目前的數(shù)據(jù)庫無法回答我的問題,，可能高通量測序不是一個(gè)有效的工具。

Q：熒光定量的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證宏基因組測出來的優(yōu)勢菌,，是否有必要,？

A：這取決于對你是否有幫助，我們之前的研究中會去做,，是因?yàn)椴惶嘈磐ㄟ^PCR之后再來進(jìn)行定量是不是準(zhǔn)確,，但是我們也不可能每個(gè)OTU都去設(shè)計(jì)引物,，當(dāng)時(shí)我們有一個(gè)樣品中，一個(gè)已知真菌有一段特定序列我們已經(jīng)有探針,，我們發(fā)現(xiàn)通過Q-PCR做的定量和高通量做的定量相關(guān)性還是很好的,，基本上可以滿足我們對定量的需求。

Q：如果分析時(shí)某個(gè)菌種比對上的reads數(shù)特別少,，怎么確定是該物種,？該菌種是否實(shí)際存在？

A：這個(gè)問題很好,，比如一個(gè)矩陣中,，OTU在某個(gè)樣品中數(shù)據(jù)是1，那么它究竟是有還是沒有,？之前有研究也有討論這樣的問題,，這個(gè)不是那么容易得出結(jié)論的，測序深度是有一個(gè)檢測限的,，如果矩陣中出現(xiàn)了1和0,，并不代表這個(gè)菌是1或者0，有可能在一個(gè)樣品中沒有測到這個(gè)菌不是因?yàn)闆]有這個(gè)菌而是因?yàn)闇y序沒有測到,，測到1可能是在樣品中它很豐富但是只測到1,，這個(gè)東西可以通過技術(shù)重復(fù)定出來，但是很少有研究會這么做,，因?yàn)檫€沒有那么大的深度應(yīng)用于擴(kuò)增子的數(shù)據(jù),。通常一個(gè)微生物群落都是有非常少數(shù)很豐富的物種和非常長的尾巴，這個(gè)尾巴就是非常多稀少物種,，越稀少測不準(zhǔn)的概率越高,。