基于高通量測(cè)序的微生物組研究技術(shù)簡(jiǎn)介

——微生物組研究，從方案設(shè)計(jì)到寫(xiě)作套路(一)

作者：王曉雯 凌波微課

版本1.0.2,，更新日期：2020年9月22日

微生物組研究的熱潮愈演愈烈,，已經(jīng)深入到我們生活的各個(gè)方面——從污染監(jiān)測(cè)到人體疾病與健康，從食品檢測(cè)到日常營(yíng)養(yǎng)——微生物的研究歷程,，也從最開(kāi)始的單菌研究,，發(fā)展到近現(xiàn)代的群體研究，再更進(jìn)一步回歸到個(gè)體的功能機(jī)制研究之上,。

研究的深入,，首先一定是伴隨著技術(shù)的完善與更新。而一項(xiàng)成功的研究一定少不了各種實(shí)驗(yàn)及分析技術(shù)的選擇和優(yōu)化整合,。

不同的研究側(cè)重,，就涉及到不同的技術(shù)選擇。包括擴(kuò)增子測(cè)序,，宏基因組測(cè)序,、宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)如何選擇和開(kāi)展應(yīng)用——是高水平科研課題面臨的第一個(gè)問(wèn)題~

技術(shù)的選擇

基于技術(shù)原理的不同，雖然同為高通量測(cè)序的手段,，但每種方法都有各自的研究側(cè)重,。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上要同時(shí)考慮到研究目標(biāo)、技術(shù)側(cè)重和成本控制等多方面問(wèn)題,。在不同的核酸水平開(kāi)展的研究,，技術(shù)形式多樣，首先就來(lái)講講這些研究復(fù)雜微生物群落的“花式”技術(shù)：

基于NGS的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)

擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)目前在研究中最常見(jiàn),，文獻(xiàn)報(bào)道也最多的微生物組高通量測(cè)序手段,。它的原理是基于微生物基因組的特征性序列(如細(xì)菌的16S rDNA，真菌的ITS等)進(jìn)行測(cè)序和分類(lèi),。簡(jiǎn)言之,，就是以小見(jiàn)大(類(lèi)似于通過(guò)指紋進(jìn)行身份識(shí)別)。它的測(cè)序范圍只是通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)微生物基因組上的特征性區(qū)域(如,，16S rDNA上的某些高變區(qū)域),，研究目的也傾向于物種的分類(lèi)識(shí)別和相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)。多樣性項(xiàng)目有一個(gè)特點(diǎn),，靶向性明確,。根據(jù)引物來(lái)確定需要研究的微生物類(lèi)群，一對(duì)引物只針對(duì)樣本中的細(xì)菌，或真菌,，或某一類(lèi)微生物群落,。

在開(kāi)展此類(lèi)項(xiàng)目時(shí)需要注意一點(diǎn)，就是適宜的引物的選擇：不同的引物在針對(duì)不同類(lèi)型的樣本研究中,，也會(huì)有一些偏向性影響,，進(jìn)而造成分析效果的差異。例如,，有報(bào)道發(fā)現(xiàn),，細(xì)菌V5-V7區(qū)引物可獲得最低的葉綠體/線粒體比例和較高的屬水平物種覆蓋度1，暗示其對(duì)排除樣本的葉綠體污染具有潛在價(jià)值,；又如,，V3-V4區(qū)引物較常見(jiàn)于人體及環(huán)境的微生物組研究，相較于其他引物,，在二代測(cè)序的細(xì)菌擴(kuò)增子研究中,，屬于物種分辨率最佳的引物，但其針對(duì)某些細(xì)菌及古菌物種的檢測(cè)準(zhǔn)確性不足2,。

基于已有研究報(bào)道,，目前細(xì)菌研究中較多見(jiàn)V3-V4區(qū)(341F-806R)、V4-V5區(qū)(515F-907R)引物,，這兩對(duì)細(xì)菌引物多見(jiàn)于腸道及土壤研究中,。針對(duì)某些植物內(nèi)生菌，比較推薦V5-V7區(qū)引物(799F-1193R)3,4,，以屏蔽細(xì)胞器基因組污染,。在各類(lèi)細(xì)菌研究中，為了降低物種檢測(cè)的偏好性,，獲得更精準(zhǔn)的物種分類(lèi)結(jié)果,，也有研究者開(kāi)始利用三代測(cè)序開(kāi)展16S全長(zhǎng)測(cè)序研究(后面有詳細(xì)介紹)。真菌研究較多選擇ITS引物,，而針對(duì)樣本中真核生物的檢測(cè)較多推薦18S區(qū)的引物,。當(dāng)然，即便是這樣有針對(duì)性的研究仍不可避免一些干擾：例如在常見(jiàn)的植物內(nèi)生真菌等研究中,，ITS和18S的引物擴(kuò)增也都不可避免有很大的宿主污染的情況,。這就需要我們采用多元的技術(shù)方法來(lái)降低干擾，如針對(duì)目標(biāo)菌群的富集培養(yǎng)或通過(guò)加大測(cè)序數(shù)據(jù)量等方式獲得更多的有效數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析等,。

此外，基于DNA和RNA不同的理化特征,，以不同類(lèi)型的核酸為模板,，可以獲得不同目的類(lèi)型的數(shù)據(jù)：以DNA為模板開(kāi)展擴(kuò)增子研究，可以獲得樣本中所有存在的特定微生物類(lèi)群,；而以RNA為模板開(kāi)展擴(kuò)增子研究,，則可獲得樣本中具有生物活性的特定菌群5,。

圖注：同一樣本中存在的細(xì)菌(DNA)及活性細(xì)菌(RNA)比較研究5

基于三代測(cè)序技術(shù)的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)

基于三代測(cè)序技術(shù)的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)：伴隨著三代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和測(cè)序成本的不斷下降，利用三代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)(如PacBio)進(jìn)行長(zhǎng)片段的擴(kuò)增和序列讀取成為擴(kuò)增子測(cè)序發(fā)展的熱門(mén)方向,。由于三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)的技術(shù)優(yōu)勢(shì),，使得16S全長(zhǎng)測(cè)序成為可能。更長(zhǎng)讀長(zhǎng)帶來(lái)的是更加豐富的序列信息,，顯著提升了基于NGS測(cè)序所達(dá)不到的高水平物種識(shí)別精確度,、分辨率及對(duì)樣本中微生物群落的還原度(下圖)6。

圖注：以99％的序列相似性對(duì)每個(gè)可變區(qū)的序列進(jìn)行聚類(lèi)時(shí)創(chuàng)建的OTU數(shù)(虛線表示原始數(shù)據(jù)庫(kù)中唯一序列的數(shù)量)6

圖注：不同可變區(qū)引物在物種鑒定中分類(lèi)能力存在差異,，且具有分類(lèi)偏好性,。其中，V4區(qū)無(wú)法鑒定的物種最多,，V1-V9全長(zhǎng)區(qū)域可實(shí)現(xiàn)分類(lèi)鑒定的物種最多6,。

基于擴(kuò)增子技術(shù)的功能基因研究

*基于擴(kuò)增子技術(shù)的功能基因研究：除了上述針對(duì)細(xì)菌真菌等微生物的擴(kuò)增子研究外，也有很多研究者關(guān)注環(huán)境樣本中具有特定功能類(lèi)型的菌群研究,，如產(chǎn)甲烷菌,、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等,。利用特定功能基因的保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),，開(kāi)展擴(kuò)增子測(cè)序研究，也可以獲得相應(yīng)的功能基因類(lèi)群群落結(jié)構(gòu)信息(如下圖),，這也是目前針對(duì)環(huán)境樣本中特定功能微生物研究的常用方法,。 然而，受限于功能基因的保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)質(zhì)量不高,、已知的功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)信息不足等因素,，僅利用擴(kuò)增子技術(shù)開(kāi)展菌群功能研究還是很有限的。如何滿(mǎn)足樣本水平上真正的菌群功能研究呢,？這就需要利用高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)展宏基因組研究,，一方面可以獲得菌群的構(gòu)成信息，另一方面可以實(shí)際測(cè)得樣本中功能基因的存在分布,，是深入開(kāi)展微生物組功能研究的有利技術(shù),。

圖注：堆肥中添加不同濃度Cu離子及不同發(fā)酵時(shí)間的樣本中具有nifH基因功能的物種(屬水平)的分布情況7

宏基因組測(cè)序技術(shù)

*宏基因組測(cè)序：無(wú)需擴(kuò)增，對(duì)樣本中所有存在的DNA進(jìn)行測(cè)序,，進(jìn)一步開(kāi)展物種識(shí)別鑒定和基因功能研究,。由于少了特異性擴(kuò)增的步驟，所以研究的對(duì)象不是針對(duì)某一類(lèi)型微生物,，而是樣本中所有存在的廣泛生物類(lèi)型(可參考下圖8),。非特異性擴(kuò)增研究帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)是，直接的檢測(cè)到樣本中的基因存在，可直接獲取DNA水平的基因功能的注釋,。因此,，相對(duì)于擴(kuò)增子技術(shù)而言，宏基因組的隨機(jī)(shotgun)測(cè)序更有利于研究實(shí)際檢測(cè)樣本中微生物的功能潛力,，是研究微生物組功能的不二之選,。

圖注：利用宏基因組測(cè)序和16S rDNA測(cè)序?qū)崿F(xiàn)的物種鑒定進(jìn)化樹(shù)。(A圖為宏基因組測(cè)序鑒定的物種類(lèi)型進(jìn)化樹(shù),，B圖為16S rDNA測(cè)序鑒定的物種進(jìn)化樹(shù),。后者僅包含細(xì)菌群落構(gòu)成，前者包含多個(gè)物種類(lèi)型的鑒定)8,。

基于宏基因組的功能基因研究

*基于宏基因組的功能基因研究：例如宏基因組-抗性基因研究：顧名思義,，這項(xiàng)研究是針對(duì)復(fù)雜微生物樣本中抗生素抗性基因(ARGs)的存在而開(kāi)發(fā)的。目前,，通過(guò)整合ARDB,、BacMet及CARD三大數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)復(fù)雜微生物組的宏基因組數(shù)據(jù)開(kāi)展針對(duì)抗生素抗性基因及抗金屬基因的注釋?zhuān)@得樣本中ARGs的種類(lèi)和豐度(如下圖9),，進(jìn)而研究其與樣本的相關(guān)性,。最初，該項(xiàng)目主要用于環(huán)境樣本中(如土壤,、水體,、空氣等)ARGs的分布和監(jiān)控，近些年也開(kāi)始有醫(yī)學(xué)方向的研究應(yīng)用,。當(dāng)然,，如果有其他類(lèi)型功能基因的數(shù)據(jù)庫(kù)，這部分工作明顯可以移植,，同時(shí)我們預(yù)期,，隨著研究的深入，各類(lèi)針對(duì)不同生物,、生境的功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)會(huì)越來(lái)越多,，使研究?jī)?nèi)容不局限于上述幾種常見(jiàn)的功能基因。

圖注：所有樣本中含有的ARGs種類(lèi)及豐度heatmap圖9

很多研究者在進(jìn)行微生物群體研究的時(shí)候,，都會(huì)想方設(shè)法的將其中的一些關(guān)鍵物種進(jìn)行分離,，對(duì)關(guān)鍵菌種開(kāi)展基因組研究，來(lái)描述和評(píng)估群體中單菌的功能及貢獻(xiàn),。但是這種樣本中,，并非關(guān)注的單菌都能實(shí)現(xiàn)理想的分離培養(yǎng)。在這種情況下,，基于宏基因組的手段開(kāi)展單菌基因組研究的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生：

宏基因組測(cè)序分箱

*宏基因組測(cè)序binning組裝：實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法及特點(diǎn)同常規(guī)的宏基因組測(cè)序,。在分析中引入了序列分箱 (Binning)的流程(下圖10),，利用核酸的組成信息,、物種的豐度模式等信息,，將宏基因組獲得的序列進(jìn)行聚類(lèi)，可獲得重疊群的分箱(contig binning),?；诖耍瑢?duì)樣本中優(yōu)勢(shì)的微生物種類(lèi)進(jìn)行基因組框架圖的組裝,，獲得宏基因組組裝的基因組(MAGs),。

圖注：宏基因組分箱的基本原理和流程

分箱可以說(shuō)是純粹基于算法開(kāi)展的宏基因組單菌組裝方案，在加大宏基因組測(cè)序量的前提下,，分箱組裝可以在獲得微生物群體功能信息的同時(shí),，對(duì)其中的優(yōu)勢(shì)物種開(kāi)展有針對(duì)性的基因組研究，可用于將特定的功能代謝產(chǎn)物與特定物種,、特定基因相關(guān)聯(lián)(如下圖11),，推動(dòng)微生態(tài)研究中的因果機(jī)制的探索，在疾病監(jiān)控,、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域提供菌株水平的生物靶標(biāo),，特別適用于重點(diǎn)關(guān)注微生物中優(yōu)勢(shì)菌功能及下游開(kāi)展單菌分離培養(yǎng)的培養(yǎng)組等研究中。

圖注：深層地下微生物群落的宏基因組研究,，基于分箱組裝的MAG的功能基因,，基因組大小，GC含量和MAG中16S rRNA小亞基的分布11,。

基于三代測(cè)序的宏基因組

*基于三代測(cè)序的宏基因組：伴隨著三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,，超長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)開(kāi)始走進(jìn)微生物組的宏基因組研究。三代測(cè)序兩大特色技術(shù)平臺(tái)——Pacbio & Nanopore——可以實(shí)現(xiàn)3-10Kb級(jí)別的超長(zhǎng)讀取,，能夠輕松覆蓋復(fù)雜微生物組樣本中的DNA全長(zhǎng)序列,；此外，無(wú)GC偏好性的特點(diǎn),，可以更真實(shí)地反應(yīng)菌群的復(fù)雜組成,，更準(zhǔn)確的開(kāi)展微生物組的物種分布、群落結(jié)構(gòu),、功能基因挖掘及代謝網(wǎng)絡(luò)研究,。

圖注：模擬菌群研究中不同平臺(tái)對(duì)菌種分布的還原情況12

HiC-Meta宏基因組測(cè)序

*HiC-Meta宏基因組測(cè)序：在宏基因組的基礎(chǔ)上，額外利用Hi-C(染色質(zhì)空間構(gòu)象捕獲)技術(shù)對(duì)微生物群落樣本進(jìn)行建庫(kù)(技術(shù)原理見(jiàn)下圖13),。

圖注： 利用Hi-C技術(shù)進(jìn)行宏基因組中單菌基因組組裝得技術(shù)原理13

基于Hi-C的建庫(kù)原理,，可以更好地實(shí)現(xiàn)同一細(xì)胞來(lái)源的序列的劃分，有助于對(duì)宿主與質(zhì)粒,、噬菌體與宿主菌的對(duì)應(yīng)關(guān)系開(kāi)展研究(參見(jiàn)下圖14),，獲得豐富的微生物群落元素構(gòu)成之間的互作網(wǎng)絡(luò)信息,。

圖注：污水研究中利用HiC-Meta技術(shù)，將分類(lèi)物種與其含有的質(zhì)粒,、ARG及整合子進(jìn)行關(guān)聯(lián)對(duì)應(yīng)14,。

宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

*宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：顧名思義，有別于宏基因組以DNA為研究對(duì)象,，宏轉(zhuǎn)錄組是對(duì)環(huán)境樣本中存在的RNA開(kāi)展測(cè)序,。樣本中存在的微生物不一定具有活性，或者的微生物也會(huì)根據(jù)生境的變化調(diào)節(jié)自身的基因表達(dá)和功能發(fā)揮(如下圖示15)——這就是宏轉(zhuǎn)錄組研究的意義之所在,。

圖注：所有樣本中,， 通路分布的多樣性等在DNA水平及RNA水平存在差異15。

針對(duì)樣本中所有存在的廣泛生物類(lèi)型,，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的是具有“活性”的信息——活性物種,，表達(dá)中的活性基因和活性功能。針對(duì)復(fù)雜微生物群落的動(dòng)態(tài)活性研究,，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)⑹悄?/span>不二選擇,。

宏病毒組研究

*宏病毒組研究：又名病毒宏基因組學(xué)(Viral Metagenomics)，或宏病毒組(Metavirome),，是在宏基因組學(xué)理論的基礎(chǔ)上,，結(jié)合現(xiàn)有的病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)而興起的一個(gè)新的學(xué)科分支。宏病毒組直接以環(huán)境中所有病毒的遺傳物質(zhì)為研究對(duì)象,，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出環(huán)境中所有的病毒組成,。受限于目前的技術(shù)瓶頸，根據(jù)研究的目的病毒類(lèi)型,，分為DNA病毒的宏組學(xué)研究和RNA病毒的宏組學(xué)研究(單/雙鏈 DNA/RNA需要分別建庫(kù)),。研究重點(diǎn)關(guān)注復(fù)雜樣本中潛在病毒對(duì)人類(lèi)及環(huán)境的危害，主要用于樣本中分布的病毒的物種分類(lèi),、相對(duì)豐度及相關(guān)功能信息研究,。

微生物組技術(shù)概括

目前已有報(bào)道的微生物組技術(shù)的研究應(yīng)用偏向及優(yōu)劣勢(shì)簡(jiǎn)要概括如下：

責(zé)編：劉永鑫 中科院遺傳發(fā)育所

版本更新歷史

1.0.0，2020/9/3,，王曉雯,，初稿

1.0.1，2020/9/8,，劉永鑫,，大修

1.0.2,，2020/9/22,，劉永鑫，小修

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