細(xì)胞外囊泡(EV)介導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞間生物分子交換,，使其成為治療性貨物的有前途的運(yùn)載工具,。CRISPR系統(tǒng)的基因工程是治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)等遺傳疾病的有趣途徑。近日,，Molecular Therapy雜志上的一篇文章報(bào)道發(fā)現(xiàn)利用血清的細(xì)胞外囊泡遞送CRISPR-Cas9核糖核蛋白,，修改抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因，允許dystrophin在肌纖維中表達(dá),。這種方法為快速,、安全地遞送CRISPR成分來治療DMD開辟了新的機(jī)會(huì)。

杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種遺傳性疾病,，由DMD基因的各種突變引起,，這些突變會(huì)損害抗肌萎縮蛋白（dystrophin）的表達(dá)。大約70%的患者有一個(gè)或多個(gè)外顯子缺失導(dǎo)致移碼突變,。其他30%有無義點(diǎn)突變,。目前正在研究針對(duì)這種疾病的各種治療方法。

目前只有外顯子跳躍被批準(zhǔn)商業(yè)化,。該技術(shù)使用針對(duì)剪接受體或剪接供體位點(diǎn)的反義寡核苷酸(ASO)從最終mRNA中去除患者缺失之前或之后的外顯子,。這種治療可以恢復(fù)抗肌萎縮蛋白的表達(dá)，但不一定能恢復(fù)其全部活性,。事實(shí)上,，肌營養(yǎng)不良蛋白的中心部分由24個(gè)血影蛋白樣重復(fù)(SLR)組成，其起點(diǎn)和終點(diǎn)與外顯子跨度不匹配,。因此,，取決于被刪除的外顯子，SLR結(jié)構(gòu)或多或少是正常的,，這可能導(dǎo)致嚴(yán)重貝克爾患者的表型,。

正在研究的另一種方法是使用編碼微肌營養(yǎng)不良蛋白的AAV。經(jīng)過多年的研究,，已經(jīng)產(chǎn)生了各種微肌營養(yǎng)不良蛋白基因,，并在小鼠和狗身上顯示出令人鼓舞的結(jié)果。然而,，一名年輕的DMD患者在使用微量肌營養(yǎng)不良蛋白治療的臨床試驗(yàn)期間意外死亡,，導(dǎo)致該臨床試驗(yàn)的暫停。

通過CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯已顯示出糾正或繞過DMD突變的有希望的結(jié)果：DMD小鼠脛骨前肌(TA)肌肉中的抗肌萎縮蛋白表達(dá)已通過在DMD基因中單次切割CRISPR-Cas9以觸發(fā)外顯子跳躍而得到拯救,，并通過雙切割刪除突變并創(chuàng)建雜合外顯子,。使用CRISPR堿基編輯在DMD基因中進(jìn)行核苷酸替換也成功地恢復(fù)了DMD模型中的肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)。大多數(shù)體內(nèi)CRISPR編輯的遞送方法都涉及AAV。然而,，在臨床試驗(yàn)期間,，AAV已被證明會(huì)引起許多不利影響，例如對(duì)人類的肝毒性,、神經(jīng)和血液學(xué)影響,。此外，先前暴露于天然存在的AAV的現(xiàn)有抗體以及這種治療的高昂成本,，可能阻礙了患者接受基于AAV的治療,。

最近，已開發(fā)出基于細(xì)胞外囊泡(EV)的系統(tǒng)以在體內(nèi)遞送CRISPR-Cas9,。EV由所有類型的細(xì)胞產(chǎn)生,，可以跨越生物屏障并避開單核吞噬系統(tǒng)，這些特性使它們成為有前途的藥物輸送載體,。CRISPR核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)在轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因Cas9基因后成功包裝在源自HEK293T的EV中,，該基因與對(duì)EV貨物具有高親和力的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合。使用超聲處理將RNP體外包裝到已經(jīng)純化的HEK293T衍生EV中也很成功,。使用EV傳遞CRISPR系統(tǒng)的活性劑的一大優(yōu)勢(shì)是它們?cè)试S傳遞Cas9蛋白而不是Cas9基因,，這避免了其持續(xù)表達(dá)，從而降低了免疫反應(yīng)和脫靶突變的產(chǎn)生,。然而,，癌細(xì)胞衍生的EV的使用引發(fā)了人類治療的安全問題，因?yàn)樗鼈償y帶可能與RNP共同遞送的潛在致癌物質(zhì),。

該研究證明,，可以使用從血清中純化的EV來傳遞SpCas9蛋白和2個(gè)gRNAs來刪除有問題的外顯子，而不是使用AAV或HEK293T衍生的EV,。血清EV已顯示出再生治療的巨大潛力,，特別是在營養(yǎng)不良小鼠中恢復(fù)膜完整性和肌肉功能。與其他方法相比,，血清EV為CRISPR遞送提供了一個(gè)安全且具有成本效益的高效平臺(tái),。

該研究開發(fā)了一種簡(jiǎn)單的方法，用EV裝載由SpCas9蛋白和引導(dǎo)RNA(gRNA)組成的CRISPR核糖核蛋白(RNP),。首先使用超濾和尺寸排阻色譜法從人或小鼠血清中純化EV。使用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染劑將RNPs加載到血清EVs中,，研究發(fā)現(xiàn)EVs在體外是RNPs的良好載體,，并恢復(fù)了tdTomato熒光蛋白在Ai9小鼠肌肉纖維中的表達(dá)。攜帶靶向DMD基因內(nèi)含子22和24的RNP的EV被注射到在外顯子23中具有無義突變的mdx小鼠的肌肉中,。從處理過的mdx小鼠中提取的多達(dá)19%的cDNA具有預(yù)期的外顯子23和24缺失,，允許肌營養(yǎng)不良蛋白在肌纖維中表達(dá)。這種方法為快速,、安全地遞送CRISPR成分來治療DMD開辟了新的機(jī)會(huì),。

參考文獻(xiàn)：

Majeau N, Fortin-Archambault A, Gérard C, Rousseau J, Yamégo P, Tremblay JP. SERUM EXTRACELLULAR VESICLES FOR DELIVERY OF CRISPR-CAS9 RIBONUCLEOPROTEINS TO MODIFY THE DYSTROPHIN GENE. Mol Ther. 2022 May 25:S1525-0016(22)00321-5. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.05.023. PMID: 35619556.