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發(fā)表時(shí)間：2020年12月17

摘要

在使用高通量測(cè)序技術(shù)的微生物群落生態(tài)學(xué)研究中產(chǎn)生了大量的測(cè)序數(shù)據(jù),，尤其是基于擴(kuò)增子測(cè)序的群落數(shù)據(jù)。在對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析后,，根據(jù)操作分類單元和分類分配表進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)挖掘仍然是復(fù)雜和耗時(shí)的,。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們提出了一個(gè)集成的R包--'microeco'作為處理微生物群落和環(huán)境數(shù)據(jù)的分析管道,。這個(gè)包是基于R6類系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的,，結(jié)合了微生物群落生態(tài)學(xué)研究中的一系列常用和先進(jìn)的方法,。該軟件包包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、分類群豐度繪制,、維恩圖、α多樣性分析,、β多樣性分析,、差異豐度測(cè)試和指標(biāo)分類群分析、環(huán)境數(shù)據(jù)分析,、null模型分析,、網(wǎng)絡(luò)分析和功能分析等類。每個(gè)類的設(shè)計(jì)都是為了提供一套可以讓用戶方便使用的方法,。與微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的其他R包相比,，microeco包使用起來(lái)快速、靈活,、模塊化,，為研究人員提供了強(qiáng)大而便捷的工具。microeco包可以從CRAN（The Comprehensive R Archive Network）或github（https://github.com/ChiLiubio/microeco）安裝,。

引言

高通量測(cè)序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用產(chǎn)生了大量的測(cè)序數(shù)據(jù)?，F(xiàn)在，微生物群落生態(tài)學(xué)中的測(cè)序數(shù)據(jù)分析可以任意分為生物信息學(xué)分析和隨后的統(tǒng)計(jì)分析,。生物信息學(xué)分析是一個(gè)典型的計(jì)算密集型工作,，unix/linux服務(wù)器適合這一操作。在根據(jù)擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)獲得必要的操作分類單元（OTU）表,、分類分配和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后,，下游的數(shù)據(jù)分析往往是多樣化、復(fù)雜化和耗時(shí)的,。雖然在生物信息學(xué)平臺(tái)上有一些統(tǒng)計(jì)和繪圖方法,，如QIIME（Caporaso等人，2010）,、mothur（Schloss等人,，2009）、RDP（http://rdp.cme./）和SiLVAngs（https://ngs./silvangs/）,，但要有效地進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,，需要更強(qiáng)大、靈活和全面的工具,。

R編程語(yǔ)言及其用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算的軟件包系統(tǒng)在科學(xué)應(yīng)用中因其強(qiáng)大和靈活而脫穎而出,。除了經(jīng)典的生態(tài)學(xué)軟件包，如vegan（Oksanen等人,，2019）,，還設(shè)計(jì)了幾個(gè)R軟件包來(lái)進(jìn)行基于測(cè)序的微生物群落數(shù)據(jù)的復(fù)雜分析,，如phyloseq（Mcmurdie和Holmes 2013）、microbiome（https://github.com/microbiome/microbiome）,、microbiomeSeq（http://www.github.com/umerijaz/microbiomeSeq）,、ampvis2（https://madsalbertsen./ampvis2/reference/index.html）、MicrobiomeR（https://github.com/vallenderlab/MicrobiomeR）和Rhea（Lagkouvardos等人,，2017）,。在軟件設(shè)計(jì)方面，phyloseq軟件包在S4類的基礎(chǔ)上發(fā)展良好,。microbiome,、microbiomeSeq、MicrobiomeR和ampvis2包都依賴于phyloseq包的phyloseq類,，涵蓋了微生物群落生態(tài)學(xué)研究中的一系列功能（表S1,，支持信息）。然而,，它們都缺乏與分析方法相關(guān)的封裝,，缺乏一些重要的、前沿的方法（表S1,，支持信息）,。因此，這些封裝框架對(duì)于目前微生物群落研究的數(shù)據(jù)挖掘管道來(lái)說(shuō)是不夠的,。在采用多種統(tǒng)計(jì)和繪圖方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的情況下,，迫切需要一個(gè)模塊化的軟件來(lái)減少用戶學(xué)習(xí)和使用的時(shí)間成本。Rhea軟件包有一個(gè)簡(jiǎn)短而清晰的工作流程框架,，但它缺乏許多重要的方法,，也不是一個(gè)傳統(tǒng)的基于函數(shù)的軟件包。

在此,，我們基于R6類系統(tǒng)（Chang 2019）創(chuàng)建了一個(gè)名為microeco的包,，它提供了封裝的面向?qū)ο缶幊谭妒健榉治龇椒ǖ拿恳徊糠謩?chuàng)建了類,，以使包的框架模塊化,、清晰和簡(jiǎn)短（圖1）。每個(gè)類都封裝了一系列的功能和不同的算法,。我們整合了一些常用的方法,，使軟件包支持廣泛的微生物群落分析，如LEfSe（Segata等人,，2011）,、冗余分析（RDA）、共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析,、功能預(yù)測(cè)和空模型分析（Stegen等人,，2013）,。我們還開(kāi)發(fā)了一些獨(dú)特的高級(jí)功能，如維恩圖中的分類群組成分析以及原核生物和真菌的功能冗余計(jì)算,。

microtable class

microtable class是一個(gè)基本類,，用于創(chuàng)建存儲(chǔ)輸入文件的對(duì)象和后續(xù)的數(shù)據(jù)預(yù)處理。與phyloseq包中的phyloseq類相比,，microtable類很簡(jiǎn)短,。例如，創(chuàng)建對(duì)象時(shí)需要的文件格式是用戶友好的data.frame 類,，用于所有OTU表、分類表和樣品信息表（見(jiàn)補(bǔ)充材料例1）,。用于數(shù)據(jù)預(yù)處理的內(nèi)置函數(shù)包括tidy_dataset(), filter_pollution(), rarefy_samples(), merge_samples(), merge_taxa(),。通過(guò)應(yīng)用函數(shù)tidy_dataset()，對(duì)象中所有的基本文件都可以被修剪,，并具有一致的信息,。如果各樣本的序列數(shù)差別很大，建議使用rarefy_samples()使每個(gè)樣本的序列數(shù)相等（小編注釋：rarefy_sample 函數(shù)功能是對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)OTU進(jìn)行抽平處理）,，以減少測(cè)序深度對(duì)α-和β-多樣性計(jì)算的影響,。運(yùn)行cal_abund()可以自動(dòng)計(jì)算每個(gè)分類等級(jí)的分類群豐度，并返回一個(gè)包含所有表格的列表（taxa_abund）,。函數(shù)cal_alphadiv()用于計(jì)算α多樣性,，包括Chao1、Shannon-Wiener指數(shù),、Simpson指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育的α多樣性（Faith 1992）,。此外，函數(shù)cal_betadiv()可用于獲得β多樣性的距離矩陣,，包括Bray-Curtis,、Jaccard和UniFrac（Lozupone和Knight 2005；陳俊2018）,。

trans_abund和trans_venn class（小編注釋：該函數(shù)用于Overlap 類群分析）

為了可視化分類群的豐度變化,，我們創(chuàng)建了trans_abund類來(lái)實(shí)現(xiàn)柱狀圖、boxplot,、熱圖和餅圖的繪制方法,。trans_venn類是為文氏圖設(shè)計(jì)的，用于解讀組間共享的或特殊的類群,，包括對(duì)5個(gè)以上組的分析,。與其他維恩分析包，如VennDiagram（Hanbo Chen 2018）相比,，我們還增加了每個(gè)特定或共享部分的OTU數(shù)量或序列數(shù)量的百分比,。一般來(lái)說(shuō),，研究人員對(duì)文氏分析結(jié)果中的特定和共同部分的分類群組成感興趣。因此,，我們開(kāi)發(fā)了獨(dú)特的函數(shù)trans_venn_com()來(lái)分析每個(gè)部分的分類群組成（Mendes等人,，2011；Andrew等人,，2012）,。該函數(shù)可以將每個(gè)餾分中的OTU組成轉(zhuǎn)化為群落格式表，并返回一個(gè)新的微表對(duì)象,，用于快速繪制每個(gè)餾分的分類群組成（見(jiàn)補(bǔ)充材料例2）,。

trans_alpha class（小編注釋：該函數(shù)用于alpha多樣性數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換、繪圖和差異性統(tǒng)計(jì)）

trans_alpha類被設(shè)計(jì)用來(lái)將microtable對(duì)象的alpha多樣性表轉(zhuǎn)化為其他格式的統(tǒng)計(jì)和繪圖,。函數(shù)cal_diff()可以通過(guò)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)或ANOVA（方差分析）對(duì)所有α多樣性指數(shù)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn),，并進(jìn)行多重比較。下面的函數(shù)plot_alpha()用于展示α多樣性數(shù)據(jù),，并通過(guò)多重比較或成對(duì)比較直接添加顯著性,。

trans_beta class

微生物群落數(shù)據(jù)的生態(tài)學(xué)分析中的一個(gè)關(guān)鍵部分是β多樣性，這可以用trans_beta類來(lái)進(jìn)行,。trans_beta類目前實(shí)現(xiàn)了幾種常用的無(wú)約束排序方法,，如主成分分析、主坐標(biāo)分析（PCoA）和非計(jì)量多維縮放（NMDS）等,。此外,，同一組或不同組的樣本之間的距離可以表明組內(nèi)或組間的群落異同（Lim等人，2015）,。函數(shù)cal_group_distance()和plot_group_distance()可以分別進(jìn)行群落距離的變換和繪制,。聚類分析和繪圖也在函數(shù) plot_clustering()中實(shí)現(xiàn)。此外,，為了簡(jiǎn)化包羅萬(wàn)象的多元方差分析（perMANOVA）的使用,，我們開(kāi)發(fā)了函數(shù)cal_manova()，用于perMANOVA的總體比較,、配對(duì)組比較和多因子比較,。

trans_diff class（小編注釋：該函數(shù)用于篩選不同分組間差異的物種或類群）

指標(biāo)類群的鑒定對(duì)于解釋不同群體間群落結(jié)構(gòu)差異的生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。隨著微生物群落生態(tài)學(xué)中測(cè)序數(shù)據(jù)復(fù)雜性的增加,，評(píng)估各組間有顯著差異的分類群是一個(gè)挑戰(zhàn),。因此，一些工具,，如LEfSe（Segata等人,，2011），結(jié)合了監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)和差異豐度測(cè)試的優(yōu)勢(shì)，以確定區(qū)分一個(gè)群體與其他群體的重要指標(biāo)類群,。trans_diff類目前實(shí)現(xiàn)了三種著名的方法,。LEfSe（Segata等人，2011）,，隨機(jī)森林（An等人,，2019）和metastat（White, Nagarajan and Pop，2009）,。LEfSe結(jié)合了線性判別分析（LDA）和差異豐度測(cè)試來(lái)尋找指標(biāo)類群,。與Python版本相比，trans_diff類中的LEfSe方法是用R代碼重新實(shí)現(xiàn)的,，以減少對(duì)軟件的依賴,。同時(shí)，結(jié)果的繪制（LDA得分的柱狀圖和支系圖）也易于使用該軟件包進(jìn)行調(diào)整,。我們整合了隨機(jī)森林分析和差異豐度測(cè)試,，與randomForest軟件包相比，增加了隨機(jī)森林方法的便利性和力量,。metastat方法在兩組之間的差異豐度測(cè)試中特別有用（White, Nagarajan and Pop 2009）。我們實(shí)現(xiàn)了metastat方法以減少文件格式轉(zhuǎn)換的工作量,，并增加了相應(yīng)的繪圖功能,。

trans_env class

評(píng)估環(huán)境因素對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)于推斷支配群落組裝的基本機(jī)制至關(guān)重要,。在trans_env類中,，冗余分析（RDA）和基于距離的RDA（db-RDA）在cal_rda()中基于素描函數(shù)rda()實(shí)現(xiàn)。為了方便RDA結(jié)果的可視化,，我們?cè)趖rans_rda()和plot_rda()中分別加強(qiáng)了轉(zhuǎn)換和繪圖的方法,。環(huán)境數(shù)據(jù)和β-多樣性距離矩陣之間的mantel檢驗(yàn)可以通過(guò)cal_mantel()對(duì)所有環(huán)境變量和所有距離矩陣進(jìn)行方便的計(jì)算。相關(guān)熱圖是展示分類群豐度和環(huán)境因素之間相關(guān)性的重要方法,。這可以通過(guò)使用trans_env類的兩個(gè)步驟完成,。首先，分類群和環(huán)境因素之間的相關(guān)性可以用cal_cor()計(jì)算所有樣品或在不同組內(nèi)進(jìn)行,。然后,，可以使用ggplot2包風(fēng)格的相關(guān)熱圖或帶有聚類圖的pheatmap包風(fēng)格的相關(guān)熱圖進(jìn)行plot_corr()，即使相關(guān)分析是針對(duì)不同組的,。

trans_nullmodel class

近幾十年來(lái),，系統(tǒng)發(fā)育分析和null模型的整合，通過(guò)增加系統(tǒng)發(fā)育的維度,，更有力地促進(jìn)了生態(tài)位和中性（niche and neutral）對(duì)群落組合影響的推斷（Stegen等人,，2013）。trans_nullmodel類提供了一個(gè)封裝，包括系統(tǒng)發(fā)育信號(hào),、β平均成對(duì)系統(tǒng)發(fā)育距離（βMPD）,、β平均最近分類群距離（βMNTD）、β最近分類群指數(shù)（βNTI）,、β凈相關(guān)度指數(shù)（βNRI）和基于Bray-Curtis的Raup-Crick（RCbray）的計(jì)算,。系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)分析的方法是mantel correlogram（Liu等人，2017）,。betaMNTD和betaMPD的算法經(jīng)過(guò)優(yōu)化,，比picante包（Kembel等人，2010）的算法更快,。RCbray和betaNTI（或betaNRI）之間的組合可用于推斷特定假設(shè)下主導(dǎo)群落集合的每個(gè)生態(tài)過(guò)程的強(qiáng)度（Stegen等人,，2013；Liu等人,，2017）,。這可以通過(guò)函數(shù)cal_process()解析每個(gè)推斷過(guò)程的百分比來(lái)實(shí)現(xiàn)。

trans_network class

微生物生態(tài)學(xué)中的共現(xiàn)模式分析是一個(gè)熱門話題,，通常是應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)分析的方式進(jìn)行分析,。在trans_network類中，提供了三種網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法：相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（Deng等人,，2012）,、SPIEC-EASI（SParse InversE Covariance Estimation for Ecological Association Inference）網(wǎng)絡(luò)（Kurtz等人，2015）和基于概率圖形模型（PGM）的網(wǎng)絡(luò)（Tackmann, Matias Rodrigues and Mering 2019）,。對(duì)于基于相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)（圖2中的步驟1）,，三種相關(guān)計(jì)算方法是可選的，包括cor.test函數(shù),、WGCNA包（Langfelder和Horvath 2008）和SparCC（Friedman和Alm 2012）,。相關(guān)系數(shù)的優(yōu)化可以選擇使用基于隨機(jī)矩陣?yán)碚摰姆椒ǎ―eng等人，2012）,。另一種網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法是SpiecEasi R包中的SPIEC-EASI（Kurtz等人,，2015）。我們實(shí)施的第三種網(wǎng)絡(luò)方法是PGM網(wǎng)絡(luò),，它可以自動(dòng)調(diào)用系統(tǒng)中的Julia語(yǔ)言和FlashWeave包（Tackmann, Matias Rodrigues and Mering 2019）,。用函數(shù)save_network()和默認(rèn)設(shè)置保存網(wǎng)絡(luò)可以生成network.gexf文件，該文件可以用Gephi軟件（https://）打開(kāi),，用于網(wǎng)絡(luò)可視化,。模塊分類、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩院凸?jié)點(diǎn)拓?fù)鋵傩缘挠?jì)算都是基于igraph軟件包（Csardi and Nepusz 2006）開(kāi)發(fā)的,?？焖儇澙返哪K優(yōu)化算法通過(guò)igraph中的cluster_fast_greedy()函數(shù)實(shí)現(xiàn)了模塊的分類,。在PCA分析的基礎(chǔ)上，提取每個(gè)模塊的OTU豐度矩陣的第一個(gè)主成分作為模塊的eigengenes,，以揭示高階組織信息（Deng等人,，2012）。模塊的eigengene分析由函數(shù)cal_eigen()提供,。此外,，我們還開(kāi)發(fā)了函數(shù)subset_network()用于提取網(wǎng)絡(luò)的一部分，函數(shù)cal_sum_links()用于總結(jié)任何分類等級(jí)的分類群之間的聯(lián)系,。

trans_func class

功能分析是微生物群落數(shù)據(jù)分析中一個(gè)有吸引力的部分,，主要來(lái)自其對(duì)生物學(xué)問(wèn)題的可解釋性。在微生物群落生態(tài)學(xué)中,，探索功能冗余是一個(gè)挑戰(zhàn),，因?yàn)楹茈y識(shí)別OTU或物種的功能特征。為了使這種分析在trans_func類中可行,，我們開(kāi)發(fā)了cal_spe_func()函數(shù),，將OTU的分類分配與原核生物的FAPROTAX數(shù)據(jù)庫(kù)（Louca, Parfrey and Doebeli 2016）的分類信息或與真菌的Funguild數(shù)據(jù)庫(kù)（Nguyen et al. 2016）的分類信息自動(dòng)匹配（圖3的步驟1）。FAPROTAX數(shù)據(jù)庫(kù)是根據(jù)Bergey's Manual of Systematic Bacteriology和相關(guān)文獻(xiàn)的信息建立的,，所以原核生物性狀鑒定的結(jié)果是可靠和保守的,。隨后，可以通過(guò)函數(shù)cal_spe_func_perc()來(lái)計(jì)算群落或網(wǎng)絡(luò)模塊中與每個(gè)性狀相關(guān)的類群（豐度未加權(quán)）或個(gè)體（豐度加權(quán)）的百分比（圖3中第2或3步）,。我們認(rèn)為一個(gè)功能性狀的百分比越高,，說(shuō)明該性狀在群落或網(wǎng)絡(luò)模塊中的功能冗余度越高。

為了方便預(yù)測(cè)和分析群落的功能潛力,，我們整合了Tax4Fun R軟件包（A?hauer等人，2015）用于元基因組代謝途徑預(yù)測(cè)（圖3中的第6步）和FAPROTAX軟件（http://www./archive/FAPROTAX）來(lái)預(yù)測(cè)群落對(duì)生物地球化學(xué)循環(huán)的功能潛力,。在獲得群落的功能潛力后,，通過(guò)使用microeco軟件包很容易進(jìn)行以下統(tǒng)計(jì)分析（圖3中的第7-9步）。

結(jié)果和討論

microeco軟件包中的案例研究涉及中國(guó)濕地土壤的16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)集（An等人,，2019）和根瘤微生物組研究的ITS擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)集（Gao等人,，2019）。詳細(xì)的樣品信息在樣品信息表（sample_info_16S和sample_info_ITS）中進(jìn)行了描述,。16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)集被用來(lái)演示本文中的例子,。數(shù)據(jù)集中的樣本可分為中國(guó)內(nèi)陸濕地（IW）、沿海濕地（CW）和西藏高原濕地（TW）,。我們提供了一個(gè)詳細(xì)的在線教程來(lái)展示microeco軟件包的使用（https://chiliubio./microeco/）,。在此，我們重點(diǎn)介紹了幾個(gè)重要的例子和相應(yīng)的代碼（見(jiàn)補(bǔ)充材料）,，可以應(yīng)用這些代碼來(lái)實(shí)現(xiàn)圖4-6的結(jié)果,。這里分析的這個(gè)例子數(shù)據(jù)的子集涉及90個(gè)樣本,，每組30個(gè)（CW、IW和TW）,。我們首先創(chuàng)建了microeco表格對(duì)象,，并按照補(bǔ)充材料例1中的代碼進(jìn)行了基本的預(yù)處理操作。在去除未分配到 "k__Archaea "或 "k__Bacteria "界中的分類群或具有 "線粒體 "或 "葉綠體 "分配信息的分類群后,，總共留下了13 296個(gè)OTU,。對(duì)OTU表進(jìn)行了抽平化處理，使各樣品的序列號(hào)相同（每個(gè)樣品有10 000個(gè)序列）,。分類群豐度,、α多樣性和β多樣性的距離矩陣都是為下游分析計(jì)算的（補(bǔ)充材料例1）。

首先,，在圖4和補(bǔ)充材料例2中顯示了幾個(gè)操作,。我們進(jìn)行了韋恩圖分析，并分析了每個(gè)共享或特定部分的OTU組成（圖4A）,。在維恩圖中加入OTU的序列號(hào)百分比來(lái)說(shuō)明每個(gè)餾分中OTU的豐度信息（圖4A）,。結(jié)果表明，CW,、IW和TW之間共享的OTU以及這些共享的OTU的豐度占總OTU數(shù)量和豐度的比例最大,。為了探索每個(gè)餾分中的分類群組成，我們對(duì)結(jié)果進(jìn)行了轉(zhuǎn)換,，得到了每個(gè)餾分的屬級(jí)的OTU組成（圖4B）,。這種方法可以幫助解釋一些分類群（這里是指屬）是由特定的還是共享的OTU組成的。例如,，在共享部分CW-IW-TW中,，Planctomyces屬的比例比其他組相對(duì)較高。接下來(lái)的例子是組間α-多樣性的配對(duì)比較,，這表明IW中的Chao1明顯高于CW（圖4C）,。為了進(jìn)一步顯示各組間的β多樣性是否存在較大差異，如補(bǔ)充材料例2所示,，進(jìn)行了基于Bray-Curtis距離的PCoA（圖4D）,。我們還用trans_nullmodel來(lái)計(jì)算βNRI，以評(píng)估不同組內(nèi)是否存在不同的系統(tǒng)發(fā)育周轉(zhuǎn)模式,。結(jié)果表明,，TW的基本系統(tǒng)發(fā)育周轉(zhuǎn)的強(qiáng)度明顯高于CW和IW（圖4E）。用LEfSe（圖4F和G）來(lái)識(shí)別指示性類群,，表明指示性類群在不同組中是不同的,。例如，Proteobacteria and Firmicutes 在CW中明顯富集（圖4F和G）,。為了進(jìn)一步探討環(huán)境因素如何影響這些指示性類群,，我們采用trans_env類將非生物因素與這些類群的豐度相關(guān)聯(lián),，并進(jìn)行相關(guān)熱圖（圖4H）。我們還評(píng)估了分類群和環(huán)境因素的聚類情況,，以揭示一些分類群比其他分類群具有更相似的生態(tài)位偏好的程度,。結(jié)果清楚地表明，相關(guān)熱圖可以提供有用的幫助,，使不同的指標(biāo)類群可能受到環(huán)境因素的影響（圖4H）,。

為了進(jìn)一步研究物種共現(xiàn)模式，我們將trans_network類應(yīng)用于相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（補(bǔ)充材料例3）,。用特定的閾值（spearman相關(guān)：R=0.7,，P=0.01）構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，并用gephi可視化（圖5A）,。我們用和弦圖來(lái)顯示門間內(nèi)部和之間的聯(lián)系數(shù)（圖5B）,。為了探索網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性，我們根據(jù)模塊內(nèi)和模塊間的連接性來(lái)分配節(jié)點(diǎn)的角色（圖5C）,。這種方法已被廣泛應(yīng)用于網(wǎng)絡(luò)分析中,，并被驗(yàn)證為對(duì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)作用的綜合評(píng)價(jià)（Deng等人，2012,；Shi等人,，2016）。然后計(jì)算模塊的eigengenes,，并與非生物因素相關(guān)（圖5D）,，揭示了模塊的OTU組成可能由不同的環(huán)境因素主導(dǎo)。需要指出的是,，在非生物因素過(guò)濾所帶來(lái)的強(qiáng)系統(tǒng)發(fā)育聚類的條件下,，相關(guān)網(wǎng)絡(luò)可能由大量與生物相互作用無(wú)關(guān)的邊組成。因此,，最好使用相關(guān)網(wǎng)絡(luò)來(lái)解釋物種生態(tài)位的相似性和其背后的機(jī)制,，而不是生物相互作用（R?ttjers和Faust 2018）（小編注釋：共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的邊數(shù)只能表征微生物之間的潛在相互作用的強(qiáng)和弱，不能直接視為為微生物之間的真實(shí)相互作用）,。

功能分析對(duì)于揭示物種共現(xiàn)模式和群落組合的結(jié)構(gòu)機(jī)制具有重要意義,。以前的研究幾乎沒(méi)有破譯過(guò)微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)模塊的功能概況,，主要是由于方法上的困難,。我們使用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)識(shí)別物種特征，并分析了網(wǎng)絡(luò)模塊的功能冗余（圖6A）,。結(jié)果顯示,，M2（第二大模塊）有很高比例的種群（OTU）具有好氧化合功能。在M4中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)N-循環(huán)和S-循環(huán)相關(guān)的種群,。然后,，我們計(jì)算了群落的功能冗余度,，并將功能冗余度與非生物因素相關(guān)聯(lián)，以探索非生物因素如何影響功能冗余度（圖6B）,。結(jié)果表明,，電導(dǎo)率和MAT（年平均溫度）都與亞硫酸鹽呼吸和光合作用相關(guān)的功能冗余有極其顯著的正相關(guān)關(guān)系。最后,，我們用綜合函數(shù)預(yù)測(cè)代謝途徑的豐度,，并在CW、IW和TW之間進(jìn)行LEfSe（圖6C）,。CW,、IW和TW中LDA得分最高的分別是遺傳信息處理、新陳代謝和環(huán)境信息處理,，這意味著每個(gè)區(qū)域的富集和指示性途徑反映了與群落結(jié)構(gòu)相關(guān)的獨(dú)特的生物和基因模式,。這一預(yù)測(cè)性的、有意義的結(jié)果可能為元基因組測(cè)序研究的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)挖掘帶來(lái)更多的希望和更深的思考,。

有必要指出的是,，隨著研究的復(fù)雜性和深度的增加，尤其是在最近十年,，統(tǒng)計(jì)和繪圖方法在微生物生態(tài)學(xué)中極為多樣,。盡管我們?cè)趍icroeco包中打包了許多常用的和獨(dú)特的方法，但不可能考慮所有的方法,，也不可能滿足這個(gè)領(lǐng)域的所有要求,。我們?cè)O(shè)計(jì)microeco包的主要理念是簡(jiǎn)單而不失力量。因此,，關(guān)鍵是如何讓研究人員快速,、方便地在該領(lǐng)域進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。我們選擇了先進(jìn)的和有代表性的方法來(lái)提高功率,，并將這些方法分為幾類,，以使框架清晰。

創(chuàng)建microeco項(xiàng)目的目標(biāo)之一是幫助研究人員縮小在學(xué)習(xí)分析方法的難度和對(duì)快速數(shù)據(jù)挖掘的需求之間一直存在的差距,，特別是對(duì)新手程序員,。目前，使用microeco軟件包可以實(shí)現(xiàn)對(duì)許多熱點(diǎn)和重大科學(xué)問(wèn)題的數(shù)據(jù)探索,，如物種共現(xiàn)模式（圖2）和功能概況（圖3）,。使用microeco軟件包的另一個(gè)好處是，它對(duì)研究者來(lái)說(shuō)具有高度的可重復(fù)性,，便于在出版物中描述復(fù)雜的方法,。

結(jié)論

microeco軟件包的特點(diǎn)是：(i)高度模塊化，每個(gè)類涵蓋了分析的各個(gè)部分,，軟件包的結(jié)構(gòu)和功能易于理解,、記憶,、搜索和使用；(ii)高度靈活性,，每個(gè)部分都實(shí)現(xiàn)了不同的算法或方法,，使分析具有靈活性；(iii)快速行動(dòng),，一些算法已被優(yōu)化,；(iv)功能強(qiáng)大，實(shí)現(xiàn)了一些前沿的方法,，如LEfSe,、網(wǎng)絡(luò)分析、空模型和功能冗余計(jì)算,。