中學(xué)課本已經(jīng)告訴我們DNA是由脫氧核糖核酸（dNTP）組成的（2'-脫氧核甘-5'-三磷酸），DNA鏈由5'-單磷酸酯連接形成,，而DNA的堿基由互補(bǔ)配對(duì)的A-T和C-G組成,。

上世紀(jì)70年代末，英國(guó)的生化學(xué)家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）提出測(cè)定DNA序列 “雙脫氧終止法”,，通過(guò)使用2’-,3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）阻斷DNA聚合反應(yīng),，這被稱為第一代DNA測(cè)序技術(shù)。隨后,，又通過(guò)在堿基上連接相應(yīng)的熒光基團(tuán),，實(shí)現(xiàn)了四種ddNTP更容易的區(qū)分，把桑格測(cè)序帶入了自動(dòng)化時(shí)代,，推動(dòng)了人類基因組計(jì)劃的實(shí)施,。

桑格雙脫氧鏈終止反應(yīng)

人們對(duì)于速度和通量的追求推動(dòng)了大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)，也就是所謂的下一代測(cè)序（NGS）,。在桑格測(cè)序中作為鏈終止子的雙脫氧核苷酸的使用,，為應(yīng)用到NGS到核苷酸 3' 末端可逆封閉基團(tuán)的開(kāi)發(fā)提供了參考。

現(xiàn)行的大多數(shù)測(cè)序是通過(guò)DNA聚合酶可以摻入核苷酸發(fā)生聚合延伸反應(yīng)的天然屬性來(lái)實(shí)現(xiàn)的,，而摻入合成反應(yīng)中的不同核苷酸的特異信號(hào)（如標(biāo)記不同顏色的熒光基團(tuán)）可以被用來(lái)推斷互補(bǔ)的靶標(biāo)核酸序列。所以,，在實(shí)施的過(guò)程中,，既需要保證DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)展，又要確保有可行的機(jī)制來(lái)查詢每次插入的核苷酸,。在ddNTP的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的可逆終止就變成了一個(gè)有效的思路,。

循環(huán)可逆終止反應(yīng)就是使用可逆終止子進(jìn)行的循環(huán)反應(yīng)，進(jìn)行核苷酸摻入,、熒光成像和切割,?？赡娼K止子就是特殊修飾的核苷酸，核心就是使用顏料標(biāo)記和具有阻止延伸反應(yīng)的基團(tuán),，理想情況下,，可被特異性摻入，在熒光成像期間或者之后被有限切割,，切割后可以成為修飾堿基或者天然堿基進(jìn)行延伸,。

循環(huán)可逆終止測(cè)序示意

主要的可逆終止子有兩種類型：3’封閉和3’未封閉。

目前被廣泛使用的3'封閉基團(tuán)包括 3'-O-烯丙基（哥倫比亞大學(xué)Jingyue Ju教授首先開(kāi)發(fā),，先是將技術(shù)獨(dú)家授權(quán)給 Intelligent Bio-Systems,，被Qiagen收購(gòu)后，由于和illumina的官司等,，戰(zhàn)略放棄了GeneReader測(cè)序儀的開(kāi)發(fā),；后相關(guān)專利獨(dú)家授權(quán)給了Singular Genomics,，成功開(kāi)發(fā)并推出了G4平臺(tái)）和 3'-O-疊氮甲基（Illumina/Solexa,，通過(guò)上文可以知道華大測(cè)序平臺(tái)也在使用這一封閉基團(tuán)，暫時(shí)沒(méi)有替換的計(jì)劃）,。3'-封閉的終止子需要切割兩個(gè)化學(xué)鍵才能從堿基上去除熒光團(tuán)并恢復(fù) 3'-OH 基團(tuán)（理想情況下,，可使用同一種試劑在相同的反應(yīng)條件下同時(shí)去除這兩個(gè)基團(tuán)）。如,，Illumina/Solexa在裂解步驟中使用還原劑三（2-羧乙基）膦 (TCEP)再生 3'-OH 基團(tuán),。

由于天然的DNA聚合酶不能有效摻入并結(jié)合3'端封閉的修飾核苷酸，所以配合修飾核苷酸的使用,，需要篩選突變型高效聚合的酶,。而這也刺激了3’不封閉的可逆終止子的開(kāi)發(fā)。在歷史上,，Helicos等公司報(bào)告過(guò)這樣的修飾核苷酸,，這些3'-未封閉的終止子依靠龐大的染料基團(tuán)的空間位阻來(lái)抑制下一個(gè)核苷酸的摻入。3'-未封閉的可逆終止子甚至可以使用野生型 DNA 聚合酶像天然核苷酸一樣摻入,。同時(shí),，只需要切割一個(gè)單鍵即可從堿基上去除終止基團(tuán)或抑制基團(tuán)和熒光基團(tuán)，這比 3' 封閉終止子更高效,。（實(shí)際上,，Helicos的四種核苷酸都標(biāo)記了相同染料，通過(guò)循環(huán)單色成像來(lái)推斷序列,。）

與終止DNA聚合反應(yīng)不同,，PacBio所提供的技術(shù)方案是實(shí)時(shí)測(cè)序，涉及在 DNA 合成過(guò)程中對(duì)染料標(biāo)記的核苷酸的連續(xù)摻入進(jìn)行成像,。熒光團(tuán)被連接到末端磷酸基團(tuán)而非而不是核堿基上,，這也減少了與 DNA 聚合酶結(jié)合的偏差,。單個(gè) DNA 聚合酶分子被附著在單個(gè)零模式波導(dǎo)檢測(cè)器（ZMW）的底面上，通過(guò)摻入結(jié)合磷化核苷酸所停留的時(shí)間及模式實(shí)現(xiàn)四色實(shí)時(shí)測(cè)序,。

3’封閉（a） 及3'-未封閉（b）的可逆終止子,，以及實(shí)時(shí)測(cè)序用的修飾核苷酸（c）。

注：圖中,，紅色化學(xué)結(jié)構(gòu)代表封閉基團(tuán),，箭頭表示將熒光團(tuán)與核苷酸分開(kāi)的切割位點(diǎn)，藍(lán)色化學(xué)結(jié)構(gòu)表示殘留的接頭結(jié)構(gòu)或分子疤痕,。

盡管循環(huán)可逆終止子測(cè)序推動(dòng)了高通量測(cè)序的發(fā)展,，但最明顯的一個(gè)問(wèn)題就是讀長(zhǎng)短，這可能的一個(gè)原因就是這些可逆終止子核苷酸類似物在攜帶熒光團(tuán)的接頭切割后留下了“疤痕”（如上圖中藍(lán)色標(biāo)記部分）,。伴隨引物延伸,，這種疤痕堆積如滾雪球,，可能會(huì)影響到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,，從而阻礙底物識(shí)別和引物延伸,。

Illumina測(cè)序中疤痕的積累示意圖，藍(lán)色的化學(xué)結(jié)構(gòu)表示留下的分子疤痕沿著DNA 雙鏈的大溝積累,。

就如之前文章中所寫(xiě)的,，通過(guò)添加一定比例的不帶熒光團(tuán)的可逆終止子，一些堿基的摻入不留痕跡,，一定程度上緩解了疤痕堆積的影響,，能部分延長(zhǎng)讀長(zhǎng)并有效解決相位不同步的問(wèn)題。后續(xù)一定會(huì)持續(xù)創(chuàng)新以出現(xiàn)疤痕更小的修飾核苷酸,。而諸如Element Bio（詳情點(diǎn)擊：到底革新了哪些測(cè)序“元素” - Element Bio親和力測(cè)序技術(shù)剖析）和Omniome那樣將（1）核苷酸識(shí)別與（2）利用不帶熒光基團(tuán)的可逆終止子進(jìn)行合成區(qū)分開(kāi)的“兩步走”SBS流程可能會(huì)逐漸驗(yàn)證其可能的優(yōu)勢(shì),？

持續(xù)關(guān)注。

參考文獻(xiàn)：

https:///10.1016/j.gpb.2013.01.003

https:///10.1038/nrg2626 

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