最近回頭重新看了illlumina paired end sequence的測序原理視頻，發(fā)現(xiàn)了以前沒有注意的一些問題,，而這些問題也是大家平時容易搞錯的,，因此花了幾天時間將illumina 的paired end sequence 從構(gòu)建文庫到上機(jī)測序的整個過程以及原理較為詳細(xì)的寫了出來,。

基礎(chǔ)知識：illumina測序的核心在于利用可逆終止的,、熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行邊合成邊測序

                  Flowcell（流動池）是有著2個或8個lane（泳道）的玻璃板，,。每個lane可以測一個樣本或者多樣本的混合物,，且隨機(jī)布滿了能夠與文庫兩端接頭分別互補(bǔ)配對或一  致的寡核苷酸（oligos，P7和P5接頭）,。一個lane包含兩列,，每一列有60個tile，每個tile會種下不同的cluster,，每個tile在一次循環(huán)中會拍照4次（每個堿基一次）,。

paried-end sequencing

一、Library Preparation文庫的構(gòu)建

  1. 利用轉(zhuǎn)座子（transposome）對雙鏈DNA進(jìn)行剪切以及接頭（adapter）的連接

  2. 接頭連接成功后,，利用低循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)在接頭處進(jìn)行修飾,，分別在兩端添加sequencing primer binding site1/sequencing primer binding site2（即測序引物結(jié)合位點）、index1/index2以及我們稱之P5和P7的寡核苷酸序列

上圖并沒有將之前的adapter標(biāo)志出來,，下圖是維基百科的示意圖,，詳細(xì)一些。

這里要注意兩點（1）P5和P7是不同的,，它們分別和flowcell上的接頭互補(bǔ)和相同,。為了方便闡述,，將與P5互補(bǔ)的接頭稱為P5’，與P7互補(bǔ)的接頭稱為P7’,。（2）index1和index2也是不同的,，與P5相連的是index2，與P7相連的是index1,。

二、Cluster generation 簇生成

  1. Flowcell上隨機(jī)分布了兩種不同的寡核苷酸序列,，分別與P5互補(bǔ)（即P5’）,，與P7一致（即P7）。

  2. 待測sequence通過P5與folwcell上的P5’序列雜交互補(bǔ),，以待測sequence為模板進(jìn)行互補(bǔ)鏈（即reverse strand）的延伸,，互補(bǔ)鏈的兩端為P5’和P7’。

  3.  接下來模板鏈被切斷并洗下

   Reverse strand的P7’與Flowcell上的P7雜交互補(bǔ),，進(jìn)行鏈的合成,，這就是我們所熟知的橋式PCR

  接下來合成的雙鏈被解鏈，再分別與Flowcell上的接頭雜交互補(bǔ),，延伸....解鏈,，雜交，延伸,，解鏈...如此重復(fù)35個循環(huán)

  4. 橋式PCR完成后,，使用NAOH將雙鏈解鏈，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）對8-氧鳥嘌呤糖苷（8-oxo-G）的選擇性切斷作用,，選擇性地將P5’與鏈的連接切斷,，留下與Flowcell上P7連接的鏈，也就是Forward strand,。同時游離的3’端被阻斷,，防止不必要的DNA延伸

三、測序

  1. 測序引物（sequencing primer）結(jié)合到靠近P5的測序引物結(jié)合位點1（sequencing primer binding site 1）上,，在系統(tǒng)中加入四種dNTP和DNA聚合酶,。這里的dNTP有兩個特點：它是有熒光基團(tuán)標(biāo)記的,，每種堿基標(biāo)記的熒光基團(tuán)不一樣。它的3’末端連了一個疊氮基,。這個疊氮基能夠阻斷后面的堿基與它相連

  因此在聚合酶的作用下,，與Forward strand相應(yīng)位置堿基配對的dNTP就會結(jié)合到新合成的鏈上，而由于疊氮基的存在,，后面的dNTP無法繼續(xù)連接,。這時用水將剩余的dNTP和酶給沖掉，將Flowcell進(jìn)行掃描,，掃描出來的熒光對應(yīng)的堿基的配對堿基即是該鏈該位置的堿基,。同時在這個Flowcell上有成千上萬個cluster也在進(jìn)行同樣的反應(yīng)，因此一個循環(huán)就能同時檢測多個樣本（這也是高通量的核心所在）,。這個循環(huán)完成后,，加入化學(xué)試劑把疊氮基和標(biāo)記的熒光基團(tuán)切掉，進(jìn)行下一個循環(huán)（堿基的連接,、檢測與切除）,。如此重復(fù)直至所有鏈的堿基序列被檢測出。也就是Forward read 序列,。

  2. Index測序：所有循環(huán)結(jié)束后,，read products 被洗掉，index1 primer與鏈上index primer1 結(jié)合位點雜交配對,，進(jìn)行index1的合成及檢測

  3. Index1測序完成后,，洗脫測序產(chǎn)物。此時機(jī)器已通過熒光得到了index1的序列

  4.Index2測序：Forward strand頂端的P5序列與Flowcell上的P5’雜交配對,，進(jìn)行index2測序,。測序完成后洗脫產(chǎn)物

四、Paried-end sequencing（即對Reverse strand測序）

  1. 洗脫index2測序產(chǎn)物后,，以Flowcell上的P5’為引物，F(xiàn)orward strand為模板進(jìn)行橋式擴(kuò)增,，得到雙鏈

  2. NAOH使雙鏈變性為單鏈,，并洗去已經(jīng)測序完成的Forward strand

  3.   類似的，readprimer2結(jié)合到靠近P7’的read primer binding site 2開始對Reverse strand的測序,。測序完成后即可得到Reverse read序列,。

總結(jié)：有兩點需要重點注意：（1）DNA片段連接的兩個接頭P5和P7，它們與Flowcell上的兩種寡核苷酸序列分別互補(bǔ)和相同,，并不是都相同

                                               （2）結(jié)合在DNA片段兩端的index序列也不同,，分別是index1和index2

前面介紹的都是paired-end的測序，而single-end測序方式是只將index,，sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端,，另一端直接連上P5/P7,，將片段固定在Flowcell上橋式PCR生成DNA簇，然后單端測序讀取序列

最后給出illumina的官方視頻