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推出時(shí)間：1977年發(fā)明,，1986年第一臺(tái)商業(yè)化測(cè)序儀Sanger法測(cè)序的原理就是，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之?dāng)U增,，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止,。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G,、A,、T或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定,。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整,，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷,。它們具有共同的起始點(diǎn),，但終止在不同的的核苷酸上,，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè),。優(yōu)點(diǎn)：測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn),，讀長(zhǎng)長(zhǎng)主流型號(hào)：Genome Sequencer FLX Titanium在測(cè)序時(shí),，使用“Pico Titer Plate” （PTP）的平板,，它含有160多萬個(gè)由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物,。測(cè)序開始時(shí),，放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T,、A,、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板,，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基,。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸,。這個(gè)焦磷酸在各種酶的作用下,，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將熒光素氧化成氧化熒光素,，同時(shí)釋放出光信號(hào),。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì),，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào),；由此一一對(duì)應(yīng),，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列,。優(yōu)點(diǎn)：讀長(zhǎng)長(zhǎng)，使得后繼的序列拼接工作更加高效,、準(zhǔn)確。速度快,，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)耗時(shí)10個(gè)小時(shí)，獲得4-6億個(gè)堿基對(duì)缺點(diǎn)：無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度,，所以檢測(cè)插入缺失突變的誤差率高,；通量小且費(fèi)用高測(cè)序引物與接頭可以互補(bǔ)雜交，其5‘端可與和鄰近序列互補(bǔ)的寡核苷酸相連,。八聚體寡核苷酸可競(jìng)爭(zhēng)性與引物相連接（該寡聚體的第四位和第五位為熒光標(biāo)記位點(diǎn)）,。當(dāng)其標(biāo)記顏色被讀取后,，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標(biāo)記,，進(jìn)行下一輪反應(yīng),，以此依次循環(huán)。在第一輪反應(yīng)中,，可以得到確定的堿基位點(diǎn)為：4,、5、9,、10,、14、15位堿基等,。重復(fù)該反應(yīng)過程,，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個(gè)堿基的引物進(jìn)行反應(yīng),，可以確定的堿基位點(diǎn)包括：3,、4、8,、9,、13、14等,，如此往復(fù),，直至偏移至引物的第一個(gè)堿基（即待測(cè)序列0位點(diǎn)堿基）。由于該位點(diǎn)堿基已知,，可通過讀取的熒光顏色得知位點(diǎn)1的堿基類型,，然后，又以位點(diǎn)1堿基熒光顏色推知位點(diǎn)2的堿基類型,，依此類推,，直至整個(gè)序列讀序完成。優(yōu)點(diǎn)：高準(zhǔn)確性,，每個(gè)DNA堿基檢測(cè)2次,，增加了序列讀取的準(zhǔn)確性缺點(diǎn)：運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)堿基替換突變的誤差率高主流型號(hào)：Illumina HiSeq2000這種測(cè)序技術(shù)通過將基因組DNA的隨機(jī)片斷附著到光學(xué)透明的表面,，這些DNA片斷通過延長(zhǎng)和橋梁擴(kuò)增,，形成了具有數(shù)以億計(jì)cluster的Flowcell,，每個(gè)cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測(cè)序,。這種新方法確保了高精確度和真實(shí)的一個(gè)堿基接一個(gè)堿基的測(cè)序,，排除了序列方面的特殊錯(cuò)誤，能夠測(cè)序同聚物和重復(fù)序列,。優(yōu)點(diǎn)：通量大,，測(cè)序方式靈活，分析軟件多樣化缺點(diǎn)：在成本上目前高于第三代測(cè)序,，樣本制備過程復(fù)雜,，樣本要求相對(duì)較高企業(yè)：Helicos Biosciences主流型號(hào)：HeliScope? Single Molecule Sequencer測(cè)序原理：邊合成邊測(cè)序，可逆阻斷測(cè)序待測(cè)DNA被隨機(jī)打斷成小片段,，在每個(gè)小片段（~200 bp）的末端加上poly-dA,，并于玻璃芯片上隨機(jī)固定多個(gè)poly-dT引物，其末端皆帶有熒光標(biāo)記,，以利于精確定位,。首先，將小片段DNA模板與檢測(cè)芯片上的poly-dT引物進(jìn)行雜交并精確定位,，然后逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子,。這個(gè)終止子與Illumina的終止子可不一樣，不是四色的,，是單色的,，也就是說所有終止子都標(biāo)有同一種染料。在摻入了單個(gè)熒光標(biāo)記的核苷酸后,，洗滌,，單色成像，之后切開熒光染料和抑制基團(tuán),，洗滌,，加帽，允許下一個(gè)核苷酸的摻入,。通過摻入,、檢測(cè)和切除的反復(fù)循環(huán),，即可實(shí)時(shí)讀取大量序列,。最后以軟件系統(tǒng)輔助，可分析出完整的核酸序列,。優(yōu)點(diǎn)：真正的單分子測(cè)序,，無需前期擴(kuò)增，不引入偏向性;特別適合RNA-Seq或RNA直接測(cè)序的應(yīng)用,，因?yàn)樗苤苯訙y(cè)序RNA模板,，而無需將其轉(zhuǎn)化成cDNA,。檢測(cè)堿基替換突變的誤差率非常低，~0.2%,。缺點(diǎn)：錯(cuò)誤率高,，Insertion 1.5%，Deletion 3.0%,；Heliscope在面對(duì)同聚物時(shí)也會(huì)遇到一些困難,，但可以通過二次測(cè)序提高準(zhǔn)確度；由于在合成中可能摻有未標(biāo)記的堿基,，因此其最主要的錯(cuò)誤來源是缺失,。企業(yè)：Pacific Biosciences推出時(shí)間：2009年底Science論文發(fā)表，2010年推出主流型號(hào)：DNA Nanoball array采用了高密度DNA（玻璃板）納米芯片技術(shù)和非連續(xù),、非連鎖聯(lián)合探針錨定連接（cPAL）技術(shù)來進(jìn)行測(cè)序,。基因組隨機(jī)打斷成500bp隨機(jī)長(zhǎng)度的片段,，兩端接上接頭,，成環(huán)，限制性內(nèi)切酶酶切,，重復(fù)2次,，最終連接成一個(gè)DNA環(huán)，現(xiàn)階段4接頭建庫方法能夠支持70bp單端測(cè)序（35bp雙端測(cè)序）,。接著每個(gè)DNA環(huán)在反應(yīng)液中高速擴(kuò)增,，形成一個(gè)納米球（DNB），這樣每一個(gè)DNA環(huán)大約擴(kuò)增了200次,。然后把這些納米球平鋪到預(yù)先處理過的玻璃板上,，形成納米芯片。最后通過非連鎖聯(lián)合探針錨定連接（cPAL）技術(shù)進(jìn)行測(cè)序,，10bp長(zhǎng)的探針上有一個(gè)錨定堿基（A or T or G or C）,，其他位置都是N，通過與模板的雜交連接反應(yīng),，根據(jù)4種不同的堿基（A/T/G/C）會(huì)有四種不同的熒光信號(hào),，總共需要40種不同的錨定探針。每一種錨定探針雜交之后都會(huì)進(jìn)行洗脫,。通過DNB芯片的熒光顯影結(jié)果及解碼分析,，可以確定每個(gè)DNB的核酸序列。優(yōu)點(diǎn)：測(cè)序自動(dòng)化,，成本低,，通量大缺點(diǎn)：讀長(zhǎng)短，分析軟件不公開,，樣品要求高企業(yè)：Pacific Biosciences這項(xiàng)技術(shù)的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide（零波段邊界）,。測(cè)序的平臺(tái)上有幾萬個(gè)小井,，單個(gè)DNA聚合酶和要測(cè)序的DNA鏈固定在每一個(gè)小井里。帶有熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每個(gè)小井里,。每一種脫氧核苷酸在激化后分別能放出不同波長(zhǎng)的熒光,。小井的底部開了一個(gè)非常小的孔，小到比探測(cè)激光的單個(gè)波長(zhǎng)還要短,。根據(jù)我們的常識(shí),，這個(gè)孔太小了，激光無法從井的底部穿過去,，從而無法激發(fā)脫氧核苷酸上的熒光物質(zhì),。應(yīng)此，底部的顯微鏡檢測(cè)到的是一片黑暗,。但是我們知道光線是一種波,，它會(huì)衍射，激光雖然不能完全穿過小孔照亮整個(gè)小井,，但它能透過小孔而勉強(qiáng)照亮小孔附近很小的一個(gè)區(qū)域,。而DNA聚合酶正好被固定在這個(gè)小區(qū)域。當(dāng)有單個(gè)脫氧核苷酸加載在DNA聚合酶上形成新的化學(xué)鍵時(shí),，這個(gè)脫氧核苷酸上的熒光物質(zhì)被激活而發(fā)光,，從而被顯微鏡觀測(cè)到。這種特定顏色的熒光只持續(xù)一小段時(shí)間,，應(yīng)為這個(gè)堿基在DNA鏈上合成之后,，它的熒光基團(tuán)就會(huì)被剪切掉，從而繼續(xù)下一個(gè)堿基的合成,。當(dāng)DNA鏈合成結(jié)束之時(shí)也是DNA鏈測(cè)序完成之時(shí),。但DNA聚合酶的活性會(huì)在激光照射下逐漸減弱，不能無限長(zhǎng)度的進(jìn)行合成反應(yīng),，因此DNA鏈的測(cè)序長(zhǎng)度也是有限的,。優(yōu)點(diǎn)：讀長(zhǎng)長(zhǎng)；無需PCR擴(kuò)增,，也避免了由此帶來的bias,；需要的樣品量很少；樣品制備時(shí)間花費(fèi)少,；用RS系統(tǒng)可以遠(yuǎn)程快速獲取數(shù)據(jù)和選擇測(cè)序參數(shù),；通量靈活；時(shí)間快缺點(diǎn)：準(zhǔn)確性低,，需要循環(huán)測(cè)序主流型號(hào)：Ion Personal Genome Machine?測(cè)序原理：半導(dǎo)體芯片測(cè)序該測(cè)序儀使用了一種高密度半導(dǎo)體小孔芯片,。該芯片置于一個(gè)離子敏感層和離子感受器之上，每當(dāng)有核苷酸分子被摻入時(shí)就會(huì)釋放出質(zhì)子,，而離子感受器就會(huì)感受到這種信號(hào),，知道是哪一個(gè)核苷酸被摻入，從而讀出DNA序列,。優(yōu)點(diǎn)：無以倫比的快速,，2個(gè)小時(shí)完成測(cè)序工作；Ion Torrent的化學(xué)測(cè)序原理自然簡(jiǎn)單,，無修飾的核苷酸,、無激光器或光學(xué)檢測(cè)設(shè)備，因而可達(dá)到極小的測(cè)序偏差和出色的測(cè)序覆蓋均衡度缺點(diǎn)：測(cè)序通量目前還不夠大,，增加半導(dǎo)體芯片的容量將有望提高測(cè)序儀的處理能力,。主流型號(hào)：MiSeq Personal Sequencing System測(cè)序原理：邊合成邊測(cè)序這種測(cè)序技術(shù)通過將基因組DNA的隨機(jī)片斷附著到光學(xué)透明的表面，這些DNA片斷通過延長(zhǎng)和橋梁擴(kuò)增,，形成了具有數(shù)以億計(jì)cluster的Flowcell,，每個(gè)cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測(cè)序,。這種新方法確保了高精確度和真實(shí)的一個(gè)堿基接一個(gè)堿基的測(cè)序,，排除了序列方面的特殊錯(cuò)誤，能夠測(cè)序同聚物和重復(fù)序列,。優(yōu)點(diǎn)：樣品制備簡(jiǎn)單快速,，在一臺(tái)儀器上完成測(cè)序和數(shù)據(jù)處理；可靠的化學(xué)方法,，可逆中止堿基邊測(cè)序邊合成法轉(zhuǎn)折點(diǎn)APP核心亮點(diǎn)：免費(fèi),、高效、搞的定,！
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