引文

上期推文【scATAC-seq3:常用工具—SnapATAC簡(jiǎn)介】當(dāng)中，我們主要對(duì)SnapATAC這一個(gè)工具的特點(diǎn)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的介紹,。在本期推文當(dāng)中,，我們將繼續(xù)上一次的話題,，簡(jiǎn)單介紹scATAC-seq的上游分析流程,，即最常用的Cellranger和用于SnapATAC分析的上游分析軟件snaptools,。

Cellranger 上游分析

1）版本的選擇

對(duì)于Cellranger ATAC的版本相比于RNA而言要少很多，主要可以分為2.0和1.2及之前的版本,。2.0版本相比于1.2之前的版本，在算法方面有了比較大的改動(dòng),。

首先針對(duì)于標(biāo)記PCR重復(fù)這一流程,，1.2之前的版本主要以起始位置和末端位置為基礎(chǔ)進(jìn)行標(biāo)記，造成的結(jié)果是序列的重復(fù)率會(huì)隨著可及性的增加而增加,。2.0版本則是除了基于起始和末端位置以外,，同時(shí)根據(jù)散列的barcode進(jìn)行標(biāo)記，能夠提高對(duì)標(biāo)記重復(fù)的準(zhǔn)確度,。

此外,，新舊版本的差異主要體現(xiàn)在peak calling。在舊版本當(dāng)中,，peak calling主要是基于計(jì)算得到的全局閾值,，即全局閾值以上的含有平滑信號(hào)的連續(xù)區(qū)域,，因此并不能準(zhǔn)確識(shí)別所有的motif位點(diǎn)。新版本中對(duì)背景噪聲更加敏感,，準(zhǔn)確度更高,。

2）建立索引

Cellranger ATAC的建立索引主要需要三個(gè)文件：

• 參考基因組文件、
• GENCODE上的功能元件注釋文件,、
• 轉(zhuǎn)錄因子及其motif文件,。

以建立人的GRCh38的索引為例，則需要:

• Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz,、
• gencode.v32.primary_assembly.annotation.gtf.gz,、
• JASPAR2018_CORE_non-redundant_pfms_jaspar.txt

這三個(gè)文件為基礎(chǔ)進(jìn)行建立。

具體建立索引的步驟可以參考 https://support./single-cell-atac/software/release-notes/references

3）cellranger-atac count

scATAC的現(xiàn)在基本上從公司拿到的數(shù)據(jù)都是fastq結(jié)尾的原始文件,，則直接可以從cellranger-atac count這個(gè)步驟開始運(yùn)行,。

cellranger-atac count   --id=sample345 \
                        --reference=/opt/refdata-cellranger-arc-GRCh38-2020-A-2.0.0 \
                        --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
                        --sample=mysample \
                        --localcores=8 \
                        --localmem=64

和RNA相似，只是將參數(shù)中的--transcriptome調(diào)整為--reference,。需要注意的是如果沒(méi)有設(shè)置localcores和localmem,，將會(huì)運(yùn)用系統(tǒng)中可用的所有線程和內(nèi)存。

4) 運(yùn)行結(jié)果

Outputs:
- Per-barcode fragment counts & metrics:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/singlecell.csv
- Position sorted BAM file:                     /home/jdoe/runs/sample345/outs/possorted_bam.bam
- Position sorted BAM index:                    /home/jdoe/runs/sample345/outs/possorted_bam.bam.bai
- Summary of all data metrics:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/summary.json
- HTML file summarizing data & analysis:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/web_summary.html
- Bed file of all called peak locations:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/peaks.bed
- Raw peak barcode matrix in hdf5 format:       /home/jdoe/runs/sample345/outs/raw_peak_bc_matrix.h5
- Raw peak barcode matrix in mex format:        /home/jdoe/runs/sample345/outs/raw_peak_bc_matrix
- Directory of analysis files:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/analysis
- Filtered peak barcode matrix in hdf5 format:  /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_peak_bc_matrix.h5
- Filtered peak barcode matrix in mex format:   /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_peak_bc_matrix
- Barcoded and aligned fragment file:           /home/jdoe/runs/sample345/outs/fragments.tsv.gz
- Fragment file index:                          /home/jdoe/runs/sample345/outs/fragments.tsv.gz.tbi
- Filtered tf barcode matrix in hdf5 format:    /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_tf_bc_matrix.h5
- Filtered tf barcode matrix in mex format:     /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_tf_bc_matrix
- Loupe Browser input file:                     /home/jdoe/runs/sample345/outs/cloupe.cloupe
- csv summarizing important metrics and values: /home/jdoe/runs/sample345/outs/summary.csv
- Annotation of peaks with genes:               /home/jdoe/runs/sample345/outs/peak_annotation.tsv
- Peak-motif associations:                      /home/jdoe/runs/sample345/outs/peak_motif_mapping.bed

對(duì)于不同的下游分析軟件,，讀取的文件是不同的,。

• 是ArchR，讀取的是fragments.tsv.gz文件,；
• 是SnapATAC,，推薦的方式是通過(guò)將bam文件進(jìn)行轉(zhuǎn)化為snap文件或者也可以通過(guò)fragments.tsv.gz文件產(chǎn)生snap文件；
• Signac則是需要singlecell.csv,、filtered_peak_bc_matrix.h5,、fragments.tsv.gz三個(gè)文件為基礎(chǔ)進(jìn)行讀取。

所以,，我們經(jīng)常出現(xiàn)的情況是ArchR讀取的細(xì)胞數(shù)量和Cellranger產(chǎn)生的summary中的細(xì)胞數(shù)量是不同的,。

snaptools上游分析

上游分析流程（建立在fastq基礎(chǔ)上）主要含有五個(gè)步驟：

1）測(cè)序文庫(kù)拆分

2）建立索引文件

3）比對(duì)

4）數(shù)據(jù)預(yù)處理

5）產(chǎn)生表達(dá)矩陣

對(duì)于第一步主要是通過(guò)python進(jìn)行實(shí)現(xiàn)，可以參考作者提供的代碼 https://github.com/r3fang/SnapTools/blob/master/snaptools/dex_fastq.py ,。其余的步驟（2-5）可以參考https://github.com/r3fang/SnapATAC/wiki/FAQs,。如果之前運(yùn)行過(guò)Cellranger，則可以通過(guò)產(chǎn)生的bam文件進(jìn)行轉(zhuǎn)換,。

總結(jié)

本期我們主要是簡(jiǎn)單介紹了一下Cellranger ATAC的上游分析流程,。總的來(lái)說(shuō),，Cellranger ATAC的運(yùn)行時(shí)間相比RNA運(yùn)行的時(shí)間更長(zhǎng),，而在下游分析的過(guò)程當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)scATAC-seq相比于scRNA-seq的運(yùn)行時(shí)間和內(nèi)存需要的更多。在下一期推文當(dāng)中,，我們會(huì)開始介紹scATAC-seq的下游分析流程,。