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在過去的20年里,，Illumina引領(lǐng)了新一代測序（NGS）技術(shù)的變革，使探索基因組,、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組變得更簡單,，也更經(jīng)濟(jì)。Illumina推出的最新平臺(tái)NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統(tǒng),，提供了突破性的系統(tǒng)設(shè)計(jì),、創(chuàng)新的化學(xué)測序技術(shù)、可兼顧多種文庫制備方法的高兼容性,，以及機(jī)載集成式生信分析軟件,。 NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統(tǒng)均采用Illumina邊合成邊測序（SBS）化學(xué)技術(shù),，該技術(shù)支持包括NextSeq 550系統(tǒng)在內(nèi)的所有Illumina平臺(tái)。Illumina SBS化學(xué)技術(shù)生成了全球90%以上的測序數(shù)據(jù)1,，該技術(shù)可大大減少錯(cuò)誤read2,，實(shí)現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)的可靠堿基檢出3。 NextSeq 1000和NextSeq 2000系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化后增強(qiáng)了簇亮度,，減少了通道串?dāng)_,，并提高了信噪比。NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統(tǒng)結(jié)合了光學(xué)和儀器設(shè)計(jì)領(lǐng)域的最新技術(shù),，提高了數(shù)據(jù)輸出量,，降低了每次運(yùn)行的成本，同時(shí)生成用戶所期待的,，與NextSeq 550系統(tǒng)一樣的高質(zhì)量數(shù)據(jù),。 本應(yīng)用說明表明NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統(tǒng)在關(guān)鍵應(yīng)用（包括外顯子組、群體細(xì)胞和單細(xì)胞RNA基因表達(dá)）中可呈現(xiàn)出與NextSeq 550系統(tǒng)相當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)質(zhì)量,。  外顯子組測序 使用Nextera? DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents Kit（Illumina,，貨號(hào) 20025524）從NA12878基因組 DNA（gDNA）（Coriell醫(yī)學(xué)研究所）樣本中制備外顯子組文庫，再由Illumina Exome Panel（Illumina,，貨號(hào) 20020183）捕獲其中的目標(biāo)基因組區(qū)域,。 使 用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個(gè) 循 環(huán) ）（Illumina 貨號(hào) 20040557）在 NextSeq 2000*系統(tǒng)上測序，運(yùn)行配置為 2×100 bp,。為了進(jìn)行比較,，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 個(gè)循環(huán)）（貨號(hào) 20024908）在NextSeq 550系統(tǒng)上對相同文庫進(jìn)行測序，運(yùn)行配置為 2×100bp,。每臺(tái)儀器在單次運(yùn)行中可對 8 個(gè)樣本進(jìn)行多重測序,。 *盡管 NextSeq 2000系統(tǒng)的通量高于 NextSeq 1000系統(tǒng)，但兩者的性能和數(shù)據(jù)質(zhì)量不相上下,。因此,，本應(yīng)用說明中僅選用NextSeq 2000系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較研究。 使用DRAGEN? Enrichment Pipeline v3.4進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)分析,，它可在NextSeq 2000系統(tǒng)上運(yùn)行或通過BaseSpace? Sequence Hub運(yùn)行,。根據(jù) Platinum Genomes 2016 v1.0數(shù)據(jù)集評估變異檢出的準(zhǔn)確性4。 群體細(xì)胞mRNA測序 使用TruSeq? Stranded mRNA Library Prep Kit（Illumina,，貨號(hào)20020594）從通用人類參比 RNA（Coriell 醫(yī)學(xué)研究所）樣本中制備信使RNA（mRNA）文庫,。 使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個(gè)循環(huán)）在NextSeq 2000系統(tǒng)上對其測序，運(yùn)行配置為 2×76bp,。為了進(jìn)行比較,，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 個(gè)循環(huán)）在 NextSeq 550系統(tǒng)上對相同文庫進(jìn)行測序，運(yùn)行配置為 2×76 bp,。每臺(tái)儀器在單次運(yùn)行中可對24個(gè)樣本進(jìn)行多重測序,。 使用DRAGEN RNA Pipeline v3.5.112進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)分析,，它可在NextSeq 2000系統(tǒng)或BaseSpace Sequence Hub上運(yùn)行。數(shù)據(jù)與基因組參照序列聯(lián)盟的人類標(biāo)準(zhǔn)基因GRCh38（組裝 h38）進(jìn)行比對,。 單細(xì)胞RNA測序 單細(xì)胞RNA測序（scRNA-Seq）的樣本是用4重外周血單核細(xì)胞（PBMC）制備的,，后者從單個(gè)供體的全血中分離而來。使用Chromium Single Cell Gene Expression v3 Solution（10x Genomics,，貨號(hào)1000092）在Chromium Controller（10x Genomics,，貨號(hào) 120223）上從約1000個(gè)PBMC中制備文庫,。 使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個(gè)循環(huán)）在NextSeq2000系統(tǒng)上對其測序,。為了進(jìn)行比較，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（150 個(gè)循環(huán)）（Illumina,，貨號(hào)20024907）在NextSeq 550系統(tǒng)上對相同文庫進(jìn)行測序,。根據(jù)10x Genomics提供的參數(shù)設(shè)置運(yùn)行配置：read 1 28個(gè)循環(huán)，index read 8個(gè)循環(huán),，read 2 91個(gè)循環(huán),。 使用Cell Ranger scRNA-Seq分析流程（10x Genomics公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以比對read,、成簇和分析基因表達(dá),。  外顯子組測序 評估包括單核苷酸位點(diǎn)變異（SNV）和插入 / 缺失（indel）的查準(zhǔn)率和查全率、運(yùn)行輸出數(shù)據(jù)量（產(chǎn)量）,、錯(cuò)誤率,、匹配read百分比、平均靶點(diǎn)覆蓋深度和覆蓋度均一性在內(nèi)的初級(jí)和二級(jí)分析指標(biāo),。NextSeq 550和NextSeq 2000系統(tǒng)在測序數(shù)據(jù)輸出量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面都超過了公布的技術(shù)規(guī)范,，兩個(gè)測序平臺(tái)都保有出色的測序性能（表1）。這些數(shù)據(jù)表明,，NextSeq 2000系統(tǒng)和 NextSeq 550系統(tǒng)的外顯子組測序結(jié)果不相上下,，兩個(gè)平臺(tái)都能提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)和高度準(zhǔn)確的變異檢出。  表1：外顯子組測序性能相當(dāng) 群體細(xì)胞mRNA測序 NextSeq 550和NextSeq 2000系統(tǒng)在測序數(shù)據(jù)輸出量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面都超過了公布的技術(shù)規(guī)范（表2）,。通過群體細(xì)胞mRNA-Seq對特定RNA靶點(diǎn)進(jìn)行定量,，結(jié)果表明在四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)平臺(tái)之間具有良好的一致性（R2>0.99）（圖1）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了在定量 mRNA 表達(dá)水平時(shí),，NextSeq 2000系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)質(zhì)量與NextSeq 550系統(tǒng)相當(dāng),。  表2：群體細(xì)胞mRNA-Seq性能相當(dāng)  圖1：高度一致的mRNA-Seq結(jié)果——使用NextSeq 550系統(tǒng)通過細(xì)胞群mRNA-Seq 對特定 RNA 靶點(diǎn)進(jìn)行定量，并繪制在 y 軸上,。NextSeq 2000 系統(tǒng)的結(jié)果繪制在 x 軸上,。沿著 y = x 趨勢線觀察數(shù)據(jù)的一致性（四次重復(fù)試驗(yàn)的R2>0.99）。 單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測序 NextSeq 550和 NextSeq 2000系統(tǒng)在測序數(shù)據(jù)輸出量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面都超過了公布的技術(shù)規(guī)范（表3）,。在 scRNA-Seq 中使用獨(dú)特分子標(biāo)簽（UMI）對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量,，結(jié)果表明在四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)平臺(tái)之間具有良好的一致性（R2>0.99）（圖2）,。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明在開展 scRNA-Seq 研究時(shí)，NextSeq 2000系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)質(zhì)量與NextSeq 550 系統(tǒng)相當(dāng),。  表3：scRNA-Seq性能相當(dāng)  圖2：scRNA-Seq結(jié)果高度一致——使用 NextSeq 550 系統(tǒng)通過 scRNA-Seq 對單個(gè)細(xì)胞（UMI）進(jìn)行定量,，并繪制在 y 軸上。NextSeq 2000 系統(tǒng)的結(jié)果繪制在 x 軸上,。沿著 y = x 趨勢線觀察數(shù)據(jù)的一致性（四次重復(fù)試驗(yàn)的 R2>0.99）,。  NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統(tǒng)具有突破性的系統(tǒng)設(shè)計(jì)、創(chuàng)新的化學(xué)測序技術(shù)并且機(jī)載生信分析軟件,，徹底改變了臺(tái)式測序系統(tǒng)的性能,。這些平臺(tái)降低了測序成本并提高了運(yùn)行能力，同時(shí)保持了用戶對Illumina期望的高質(zhì)量數(shù)據(jù),。將常在NextSeq 550 系統(tǒng)上運(yùn)行的關(guān)鍵應(yīng)用數(shù)據(jù),，包括外顯子組、群體細(xì)胞mRNA和單細(xì)胞 RNA 測序,，直接與NextSeq 2000系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,。結(jié)果顯示，NextSeq 550和NextSeq 2000系統(tǒng)的性能高度一致,，反映了 Illumina對始終提供一致,、高質(zhì)量的測序性能的承諾。 了解更多 |
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