1 項(xiàng)目信息

1.1 基本思想

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,，基于Illumina測(cè)序平臺(tái)，通過(guò)研究某個(gè)物種在特定狀態(tài)或者特定時(shí)期下 所有的mRNA,，針對(duì)實(shí)際樣品信息采用靈活的差異分析策略可以找到生物體不同時(shí)期,、不同組織 或不同個(gè)體間差異表達(dá)的mRNA，再通過(guò)軟件進(jìn)行功能注釋,，最終可以得到mRNA在生物體中參與 生命活動(dòng)的清晰生物信息圖譜,。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程

1.2.1 樣本檢測(cè)

對(duì)總RNA的樣本檢測(cè)包括以下3種方法：

（1）1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA樣品是否有降解以及雜質(zhì)

（2）凱奧K5500分光光度計(jì)檢測(cè)樣品純度（凱奧，北京）

（3）安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit（Agilent Technologies, CA, USA）檢測(cè)RNA樣品的 完整性和濃度

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

總RNA樣本檢測(cè)合格后,，對(duì)于真核生物,，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，對(duì)于原核生 物,，用試劑盒去除rRNA,，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以 片斷后的mRNA為模板,，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈,，并加入緩沖液、dNTPs,、RNaseH和 DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈,，經(jīng)過(guò)QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純 化后的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A,、加測(cè)序接頭處理,，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的 大小片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作,。

構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,。測(cè)序策略為PE150。 其實(shí)驗(yàn)流程如下：

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.3 信息分析流程

Illumina平臺(tái)測(cè)序所得原始下機(jī)序列（Raw Reads）,，通過(guò)去低質(zhì)量序列,、去接頭污染等過(guò)程完 成數(shù)據(jù)處理得到高質(zhì)量的序列（Clean Reads），后續(xù)所有分析都是基于Clean Reads,。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息分析流程主要分為三部分：測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控,、數(shù)據(jù)比對(duì)分析和轉(zhuǎn)錄組深 層分析,。其中,，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控包括過(guò)濾測(cè)序所得序列、評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量以及計(jì)算序列長(zhǎng)度分布 等,；數(shù)據(jù)比對(duì)分析主要是針對(duì)比對(duì)到基因組中的序列,，根據(jù)不同的基因組注釋信息依次進(jìn)行分類 和特征分析，并計(jì)算相應(yīng)的表達(dá)量,；轉(zhuǎn)錄組深層分析包括差異表達(dá)分析,、可變剪接分析、新轉(zhuǎn)錄 本預(yù)測(cè)和變異分析等其他個(gè)性化分析,。具體的信息分析流程圖如下：

如項(xiàng)目?jī)H有一個(gè)樣品,，無(wú)法進(jìn)行虛線所示的分析內(nèi)容。

1.4 樣品信息 本項(xiàng)目共12個(gè)樣本,。 樣品信息示例如下:

如果您覺(jué)得有價(jià)值,，請(qǐng)把此文放到您朋友圈，大家都會(huì)感謝你