自從哈佛大學遺傳學家 George Church 和 454 Life Sciences 公司 Jonathan Rothberg 掀起下一代測序 NGS 的革命以來,，已經(jīng)過去了將近十年。毫不夸張地說,，這段時間以來 NGS 技術已經(jīng)發(fā)生了翻天覆地的變化,，在測序通量突飛猛進的同時，測序成本直線下降,。

想當年 454 Life Sciences 公司測序 580-kb 的細菌基因組,，需要四小時的工作循環(huán)。而今年一月份 Illumina 公司發(fā)布的 HiSeq X? Ten 測序系統(tǒng),，能夠以千元成本測序完整的人類基因組,，最多每天能測序 600 billion bp。

如今,，下一代測序技術給生命科學領域帶來了徹底的改變,。而 NGS 領域本身也在經(jīng)歷著某種意義上的變革。正因如此,，基因組學 Archon X 獎（Archon Genomics X Prize）不得不于 2013 年 8 月宣布取消,，因為測序成本的直線下降已經(jīng)使競賽變得毫無意義。Church 的團隊是該競賽僅有的兩只報名隊伍之一,，他認為參賽者們是否能夠完成競賽任務還很難預料,。但無論如何，既然競賽已經(jīng)啟動,，總得讓人家比完吧,。

言歸正傳，下一代測序領域的 2013 年既忙碌又喧囂,，在開年之際讓我們對這一領域發(fā)生的最新進展做個小結(jié)吧,。

454 Life Sciences

2013 年 10 月， 454 Life Sciences 宣布將于 2016 年中旬逐步淘汰其焦磷酸測序儀器，GS Junior 和 GS FLX+,。據(jù)該公司介紹,，從擴展性和成本角度看，454 平臺作為首個商業(yè)化的 NGS 系統(tǒng)已經(jīng)基本上走到盡頭,，很難再對其進行升級和改良,。Roche 的 Beth Button 指出，公司正在尋求新的測序合作伙伴,。2013 年 9 月,，該公司宣布與昔日的競爭對手 Pacific Biosciences 合作，擬基于 PacBio 公司的SMRT技術進行診斷產(chǎn)品的開發(fā),。

Illumina

2014 年 1 月 Illumina 公司發(fā)布了兩個以 Solexa 測序技術為基礎的新測序平臺,，HiSeq X Ten 和 NextSeq? 500。

據(jù)該公司介紹,，定 價$250,000 的臺式 NextSeq 500 兼具了樣品制備和測序功能,。“它按鈕式的操作,，可以在許多常見測序應用之間切換,。該系統(tǒng)能夠在一天內(nèi)測序整個人類基因組和多達 16 個外顯子組?！盢extSeq 500 運行 75 個測序循環(huán)只需 12 小時,。

HiSeqX Ten 系統(tǒng)以 10 臺儀器為單位銷售，據(jù)稱可以實現(xiàn)千元成本的人類基因組測序,。該系統(tǒng)現(xiàn)定價 1000 萬美元,，能夠在三天時間內(nèi)生成 1.8 terabases 的數(shù)據(jù)，相當于每天約 600 Gb,，比 HiSeq 2500 強十倍,。

華盛頓大學的 Elaine Mardis 表示，HiSeqX Ten 系統(tǒng)針對的應該是提供人類基因組測序的服務產(chǎn)業(yè),，因為很少有研究機構(gòu)能用到如此高的通量,。“要想實現(xiàn)千元成本,，就需要正確的樣本量,，”她說。當然,，高通量還意味著更為復雜的數(shù)據(jù)分析,。

Mardis 的團隊曾作過計算，為了跟上 HiSeqX Ten 他們可能需要花費 800 萬美元在信息學設施上,。此外,，實現(xiàn)千元成本意味著每年需要測序 18,000 到 20,000 個基因組,。“我要測序許多腫瘤基因組,，”她說,。“但數(shù)量還遠遠不夠,?！?

Life Technologies

已被 Thermo Fisher 收購的 Life Technologies 擁有兩款 NGS 平臺， SOLiD 和 Ion Torrent ,。據(jù) Thermo 的 Andy Felton 介紹,，公司已經(jīng)將工作的重心放在后者身上,?！敖^大多數(shù)研發(fā)工作已經(jīng)轉(zhuǎn)移到 Ion 上，”他說,。

目前的 Ion PGM 系統(tǒng)可使用最新的 Ion 318 芯片,，產(chǎn)出多達 6 million 400bp 的讀取，也就是說 4 小時運行的產(chǎn)量能達到 2 Gb,。而新 Ion Proton? 使用 Ion PI? 芯片,，能夠產(chǎn)出 80 million 200 bp 的讀取，即每次運行產(chǎn)量達到 10 Gb 至 14 Gb,。

據(jù)介紹,，今年公司將會推出用于轉(zhuǎn)錄組測序的新 Ion PII 芯片，每張這樣的芯片可產(chǎn)出 300 million 100bp 的讀取,，隨著系統(tǒng)改良甚至可能達到 200bp,。

此外， Life Technologies 公司正在研發(fā)一種新的聚合酶,，Hi-Q,。據(jù) Felton 介紹，Hi-Q 能“顯著提高精確性”,，減少 90% 的插入/缺失誤差,。這種酶將于今年的中旬實現(xiàn)全面商業(yè)化。

Pacific Biosciences

Pacific Biosciences 公司以長讀取的下一代測序技術著稱,。據(jù)該公司的創(chuàng)始人 Steve Turner 介紹,，在新測序化學 P5-C3 的幫助下，如今 PacificBio 的測序讀長已經(jīng)達到了 8.5kb,。P5-C3“提供了一個保護性的支架”,，可以阻止酶和熒光團之間發(fā)生身體接觸，避免酶受到潛在的光學損傷,。

“我們已經(jīng)很大程度上減少了系統(tǒng)中的光學損傷,，我們相信現(xiàn)在測序讀長受到的限制,，只來自于樣品本身，” Turner 說,。 樣品本身的限制是指,，讀長越長就越難生成不含損傷位點或缺口的測序模板，而這樣的缺口會導致測序過早中止,。

目前 PacBio ? RS II 和 SMRT Cell 系統(tǒng),，每次運行可產(chǎn)出 50,000 個讀取（約 400 million bp）,。這一數(shù)字會在接下來的一年中繼續(xù)增漲,， Turner 說?！拔覀冾A計在 2014 年內(nèi),，令測序讀長再增加50%，并于 2015 年達到 20,000bp,?！?

最近研究人員發(fā)表文章向人們展示，在新裝配方法 HGAP 的幫助下（hierarchical genome-assembly process）,，可以實現(xiàn)只利用 PacBio 化學法對真核基因組進行從頭裝配,。一月份，該公司公布了對黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）進行的完整二倍體基因組裝配,，生成了長達 24.6 Mb 的重疊群（contigs）,， N50 值為 15.2 Mb（ N50 值反映了重疊群的長度）。就在上周,， PacBio 公司又公布了一個 54x 覆蓋度的單倍體人類基因組裝配,，生成了“3.25 Gb 的基因組裝配，重疊群 N50 值為 4.38 Mb,，其中最長的重疊群達到 44 Mb,。”

Oxford Nanopore

Oxford Nanopore 公司無疑是納米孔測序的領導者,，這一技術也被稱為第三代測序,。該公司 2013 年 10 月份宣布，將在 2014 年年初推出 USB 大小的 MinION ? 測序儀,，為客戶提供先期體驗（early-access）,。

與其他類似先期體驗項目不同的是， Oxford Nanopore 公司不會局限于傳統(tǒng)的測序中心,，而是向廣大的個人用戶敞開大門,。該公司準備在接下來的一周發(fā)出邀請。

Oxford Nanopore 公司強調(diào),，不是每個 MinION Access Program（MAP）申請者都會在第一輪受到邀請,，而且公司提供的 MinION 數(shù)量也可能少于申請者的要求,。這些儀器將在六周內(nèi)進行發(fā)送。

2012 年,， Oxford Nanopore 公司在 AGBT 大會上描述了兩個測序系統(tǒng),， MinION 就是其中之一，另一個產(chǎn)品是 GridION?,。據(jù)公司發(fā)言人稱,， MinION 的大小使其更容易受到人們的關注，它的靈活性和測序能力將推動 NGS 進一步邁向普羅大眾,。

Oxford Nanopore 公司希望通過 MinION Access Program 評估測序系統(tǒng)的實用性,、對不同應用的適應性、數(shù)據(jù)分析,、以及公司的物流運輸和試劑分配等,。這些數(shù)據(jù)將有助于未來開展的 GridION 先期體驗項目，不過該公司還未公布這一項目的具體啟動時間,。

廣泛的應用前景

在下一代測序技術不斷進步的同時,，它的應用也越來越廣泛,。據(jù) Mardis 介紹,，下一代測序在臨床領域的應用快速增漲。越來越多的研究者選擇下一代測序的多基因 panel 對腫瘤進行研究,，或者通過外顯子測序鑒定潛在的藥物靶點,。在診斷兒童遺傳學疾病時，人們也逐漸拋開了傳統(tǒng)的診斷方法,，轉(zhuǎn)而使用全外顯子組測序,。

Mardis 補充到， NGS 檢測有兩大優(yōu)勢,，它既可以幫助人們確定治療方案,，也可以為患兒父母評估他們未來子女患同樣疾病的風險。實際上 Church 認為,，用下一代測序進行（致病基因）攜帶者篩查,，是 NGS 的“殺手锏”。

“任何考慮使用輔助生殖手段的人…都應當知道精子捐獻者是否攜帶與嚴重疾病有關的隱性等位基因,，”他說,。“人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個能夠預測疾病的基因,，現(xiàn)在也有不少服務可以對它們進行準確的檢測,。”

最近,， Church 作為共同作者發(fā)表了一項新研究,。據(jù)他介紹,，這是首次發(fā)表用 NGS 進行攜帶者篩查的文章，他們的方法“充分提高了質(zhì)量并且降低了成本”,。研究團隊使用padlock探針,，在194個細胞系中抽出并測序了15個有臨床意義的基因，其中55個細胞系來自于攜帶上述基因突變的個體,。

下一代測序的另一個新興的應用領域是單細胞 RNA 測序,。“單細胞 RNA 測序能向我們展示,，相同細胞中 RNA 表達的天然隨機性,，這一點非常吸引人?！? Mardis 說,。

Church 介紹到，他即將發(fā)表的一篇文章描述了一種新的測序方案,，稱為熒光原位測序（fluorescent in situ sequencing）,。這一技術將熒光原位雜交和 RNA -Seq結(jié)合起來，能夠計數(shù)并確定不同轉(zhuǎn)錄本在組織切片中的空間定位,。

Church 的團隊通過熒光原位測序證實,，轉(zhuǎn)錄本會依據(jù)傷口的愈合情況在成纖維細胞中呈不對稱分布。

這樣的數(shù)據(jù)在十年前簡直難以想象,。同樣,，我們也很難想象 NGS 在未來十年又會發(fā)生怎樣的翻天覆地的變化。

延伸閱讀：

2014年技術展望：下一代測序,、RCR/克隆,、蛋白分析、細胞分析

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Next-Gen Sequencing 2014 Update