【原】小細(xì)胞肺癌(SCLC)病人的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析

健明 2021-11-23

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文章信息

文章題目：Signatures of plasticity, metastasis, and immunosuppression in an atlas of human small cell lung cancer
期刊：Cancer Cell
日期：October 14, 2021
DOI：https:///10.1016/j.ccell.2021.09.008
數(shù)據(jù)開(kāi)源：Raw and processed data from this paper are publicly available on the Human Tumor Atlas Network(HTAN) data portal at （https://data./）

總體思路

先挖掘SCLC腫瘤細(xì)胞的特征,，再挖掘免疫環(huán)境的特征，最后將二者關(guān)聯(lián)起來(lái),。
對(duì)來(lái)自21個(gè)非小細(xì)胞肺癌(SCLC)樣本「涉及原位癌與轉(zhuǎn)移癌,，治療與未治療」、24個(gè)肺腺癌(LUAD)樣本以及4個(gè)癌旁組織樣本的155,098個(gè)細(xì)胞的進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行合并,、去除批次效應(yīng)，鑒定初步的細(xì)胞類(lèi)型(epithelial 上皮細(xì)胞, mesenchymal 間充質(zhì)細(xì)胞, lymphoid 淋巴細(xì)胞, and myeloid骨髓細(xì)胞 cells),。然后進(jìn)行如下的深入分析

僅概述了本文的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析部分,，實(shí)驗(yàn)部分及細(xì)節(jié)部分可參考原文。

1,、SCLC的異質(zhì)性高于LUAD的異質(zhì)性

首先進(jìn)一步對(duì)上皮細(xì)胞再分群,，細(xì)胞亞類(lèi)注釋?zhuān)簉espiratory epithelium呼吸上皮細(xì)胞(including alveolar epithelial肺泡上皮細(xì)胞 types 1 and 2, ciliated, club, neuroendocrine神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞, and tuft cells) and hepatocytes肝細(xì)胞 derived from liver metastases.

然后分別將neuroendocrine and alveolar epithelial type 2-like 細(xì)胞類(lèi)型代表 SCLC與LUAD腫瘤細(xì)胞?；诖?，在38個(gè)上皮細(xì)胞亞群中(64301個(gè)細(xì)胞)，SCLC有25個(gè)cluster的55815個(gè)細(xì)胞,；LUAD有5個(gè)cluster的7635個(gè)細(xì)胞（因?yàn)長(zhǎng)UAD有較高的基質(zhì)細(xì)胞占比）,；

結(jié)合病人來(lái)源分析每個(gè)cluster的異質(zhì)性如何，用Shannon entropy指標(biāo)表示,。該指標(biāo)越低,，表明該cluster越由某個(gè)病人占主導(dǎo)，異質(zhì)性越高,；越高,，表明平均由多個(gè)病人來(lái)源組成。

如上圖結(jié)果可以看出SCLC的Shannon entropy指標(biāo)低于LUAD,，表明具有相對(duì)更高的病人異質(zhì)性,。

2、SCLC分子亞型鑒定,，為后續(xù)深入分析打基礎(chǔ)

過(guò)去針對(duì)SCLC的研究,，根據(jù)4個(gè)driver基因的表達(dá)水平，可將SCLC病人歸為4個(gè)亞型之一,。由于單細(xì)胞測(cè)序的drop-out局限性,，作者嘗試用neighbor-graph-based方法，從多基因角度計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的可能性；然后結(jié)合該樣本的所有SCLC細(xì)胞可能性,，綜合判斷該樣本屬于哪一種SCLC分子分型,。

如上圖所示，將21個(gè)樣本分為14個(gè)SCLC-A亞型,，6個(gè)SCLC-N亞型,，以及1個(gè)SCLC-P亞型。由于P亞型過(guò)少,，后續(xù)會(huì)主要基于前兩個(gè)亞型進(jìn)行分析,。

3、SCLC-N亞型具有促轉(zhuǎn)移的特征

首先結(jié)合臨床信息,，SCLC-A多為原位癌,，而SCLC-N多為轉(zhuǎn)移癌，并且SCLC-N的Shannon entropy指標(biāo)低于SCLC-A,，即異質(zhì)性高,；

其次SCLC-A與SCLC-N的差異分析以及富集分析結(jié)果表示 SCLC-A富集細(xì)胞周期與DNA修復(fù)等通路；而 SCLC-N富集促轉(zhuǎn)移的特征通路,。

此外,，從基因?qū)脖磉_(dá)的角度來(lái)看，SCLC-N細(xì)胞的配體-受體作用強(qiáng)度高于SCLC-A細(xì)胞（有待驗(yàn)證）

4,、SCLC的非異質(zhì)性亞群具有促轉(zhuǎn)移特征,、干性

如上所述，SCLC細(xì)胞具有較高的異質(zhì)性,，但這與SCLC具有普遍的低預(yù)后共性相矛盾,。于是作者從25個(gè)SCLC亞群中，如下圖所示,，發(fā)現(xiàn)了cluster22具有最高的Shannon entropy指標(biāo)（多個(gè)病人來(lái)源）,，于是重點(diǎn)關(guān)注這個(gè)亞群的特征。

首先由于多個(gè)病人來(lái)源組成,，該cluster的SCLC所屬亞型難以確定,，提示一種未分化的表型特征；

其次這個(gè)cluster相對(duì)富集轉(zhuǎn)移相關(guān)以及神經(jīng)干細(xì)胞通路,，其中最上調(diào)的基因?yàn)镻LCG2,，它的同源基因PLCG1有研究指出可以促進(jìn)新陳代謝；結(jié)合PLCG2的基因表達(dá),，進(jìn)行共表達(dá)分析,，相關(guān)高表達(dá)模塊基因富集通路也提示與干細(xì)胞特性、促轉(zhuǎn)移信號(hào)通路相關(guān),。

作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PLCG2在轉(zhuǎn)移癌組織中表達(dá)水平高,。對(duì)細(xì)胞系的PLCG2基因過(guò)表達(dá)與敲除實(shí)驗(yàn),、以及WB實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了PLCG2基因是這個(gè)cluster的關(guān)鍵基因。

再結(jié)合病人的生存數(shù)據(jù),，表明PLCG2基因高表達(dá)，以及較高的該cluster占比與病人較低的預(yù)后生存時(shí)間相關(guān)

5,、SCLC的免疫微環(huán)境(immune TME)低于LUAD

SCLC被認(rèn)為是一種immune-cold癌癥,，即目前熱門(mén)的免疫治療效果一般；

作者試圖分析不同亞型的SCLC免疫微環(huán)境是否存在差異,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCLC-N(或者說(shuō)NEUROD1陽(yáng)性)腫瘤亞型是存在較低的免疫浸潤(rùn)水平,；

并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)盡管免疫浸潤(rùn)水平較高的SCLC，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用水平也較低,。

6,、SCLC-N與-A亞型的T細(xì)胞組成比例存在差異

首先對(duì)SCLC的T,Myeloid細(xì)胞亞群進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型注釋?zhuān)?/p>

然后使用非負(fù)矩陣分解方式(樣本細(xì)胞類(lèi)型矩陣=樣本表型矩陣 * 表型細(xì)胞類(lèi)型矩陣)鑒定出來(lái)30個(gè)factor，其中影響T細(xì)胞注釋的有七個(gè)表型相關(guān)因素：CD4+ regulatory (Tregs, factor 4), CD4+ conventional (Tconv, factors 19 and 23),，CD8+ exhausted (Texh, factor 7), CD8+ memory (Tmem, factor 12),CD8+ effector (Teff, factor 28), and CD8+ gamma delta T cells(Tgd, factor 29)

根據(jù)作者發(fā)現(xiàn)SCLC-N表型相對(duì)SCLC-A表型含有較低的ratio of CD8+ effector to Treg factor loadings,，即含有相對(duì)較少的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

7、SCLC纖維化相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群鑒定

首先作者對(duì)SCLC的myeloid細(xì)胞進(jìn)行重新聚類(lèi)分群,，包含7個(gè) monocyte/macrophage亞群,。并且發(fā)現(xiàn)其中的4個(gè)亞群(1,7,9,12)高表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因；

所以作者嘗試比較這4個(gè)亞群與 idiopathic pulmonary fibrosis特發(fā)性肺纖維化 (IPF)的相似性,，其中cluster1,、7最相似；具體來(lái)說(shuō)cluster1的促纖維化巨噬細(xì)胞基因集特征最像IPF,；而cluster7的單核細(xì)胞基因集特征最像IPF

8,、PLCG2-high SCLC population 與免疫細(xì)胞亞群的關(guān)聯(lián)性

在之前發(fā)現(xiàn)的一個(gè)低異質(zhì)性SCLC腫瘤細(xì)胞亞群(PLCG2-high SCLC population)具有促轉(zhuǎn)移特征，因此作者想分析是否與上述鑒定的profibrotic Mono/Mψ亞群相關(guān),。如下圖所示的確存在顯著的相關(guān)性,。