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胚胎遺傳前遺傳學(xué)檢查（PGT）是在人類輔助生殖技術(shù)的基礎(chǔ)上,，對配子或胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析,，診斷配子或胚胎是否有遺傳缺陷，然后選擇未見異常的胚胎植入子宮,。PGT最初采用基于分子雜交或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測方法,隨后微陣列技術(shù)也被應(yīng)用其中,。隨著人類基因組計(jì)劃的完成,DNA測序技術(shù)進(jìn)入高速發(fā)展的階段,二代測序(NGS)采用鳥槍法為基本測序策略,結(jié)合生物信息學(xué)工具,以高通量,、較低成本,、檢測項(xiàng)目覆蓋面廣、自動化程度高,、可檢測未知片段等優(yōu)勢,正不斷擴(kuò)大在PGT中的應(yīng)用,同時(shí)也對輔助生殖技術(shù)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響,。 必須嚴(yán)格采用ICSI授精方式，防止精子滯留于透明帶中而被父源遺傳物質(zhì)污染,；為避免母源遺傳物質(zhì)的污染,，在ICSI前應(yīng)將卵丘顆粒細(xì)胞清除；為保證活檢取樣的準(zhǔn)確性,，胚胎應(yīng)嚴(yán)格采用單滴培養(yǎng),，確保活檢樣本與活檢后的胚胎嚴(yán)格一一對應(yīng),。如果上述中存在污染現(xiàn)象,，將嚴(yán)重影響PGS/PGD結(jié)果的準(zhǔn)確性。 
胚胎活檢是PGT過程中涉及的對胚胎的主要操作,，運(yùn)用PGD/PGS進(jìn)行遺傳學(xué)診斷的材料可以來源于體外受精-胚胎培養(yǎng)的各個(gè)階段,，常見的材料來源主要有受精前后的第一極體、二極體,，受精3天后6-10細(xì)胞期的卵裂球細(xì)胞,，受精5-7天囊胚期的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。胚胎活檢作為一項(xiàng)創(chuàng)作性的顯微操作,，需要十分謹(jǐn)慎的操作,。如果操作不當(dāng)或者方法選擇不當(dāng)，不僅會影響胚胎的發(fā)育能力，對活檢樣本也可能造成操傷,，從而影響PGT結(jié)果的準(zhǔn)確性,。 目前最常用的是囊胚期疝形成后通過激光法取5-10個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測。囊胚期活檢由于取5-10個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞,。其原理是采用激光消除透明帶,，對胚胎無直接影響，且可靈活調(diào)節(jié)空洞大小,，操作簡便,。
采集滋養(yǎng)細(xì)胞后，進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（WGA）,，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序,，得到數(shù)以萬計(jì)的堿基序列讀段（reads），與人類基因組參考序列比對,，可將reads定位到基因組上,。而后通過選取一定長度的窗口，可對窗口內(nèi)的reads進(jìn)行計(jì)數(shù),，從而作為該窗口的信號值，該信號會隨著測序濃度的增加和窗口的增大而趨于穩(wěn)定,，這些擁有穩(wěn)定信號的窗口就是用于判定染色體異常的基礎(chǔ),。對于二倍體區(qū)域，將信號值與正常值比較,，則可判定為染色體正常,、重復(fù)或缺失。目前主要適用于自然流產(chǎn)3次及以上,，或2次自然流產(chǎn)且其中至少1次流產(chǎn)物檢查證實(shí)存在病理意義的染色體或基因異常的患者,；反復(fù)種植失敗（移植優(yōu)質(zhì)胚胎3次及以上,，或移植≥10個(gè)可移植胚胎)的患者）; 嚴(yán)重的男性不育患者即存在少弱精子癥,、畸精癥等癥狀的患者。
首先通過測序儀自帶程序進(jìn)行基礎(chǔ)分析：包括原始數(shù)據(jù)（Illumina平臺原始數(shù)據(jù)為fastq格式,；ThermoFisher平臺為bam格式）,、數(shù)據(jù)過濾（可將測序質(zhì)量值 《17且序列<35bp的片段除去，以提高比對結(jié)果的可靠性）,、序列比對（通過計(jì)算得到序列對應(yīng)參數(shù)基因組的位置,，常用比對軟件有Bowtie2及BWA）及生成比對結(jié)果（輸出結(jié)果為bam格式）4步。隨后根據(jù)不同的醫(yī)學(xué)需要選擇特定的分析,，用于PGS的數(shù)據(jù)分析則需要繼續(xù)進(jìn)行除重復(fù)序列（用于除去由于PCR擴(kuò)增偏好引起的重復(fù)序列,，常用軟件有SAMtools及Picard tools）、有效讀數(shù)計(jì)算（比對質(zhì)量值≥10且序列長度＞35 bp的片段被認(rèn)為是有效片段）,、GC校正（去除由于GC含量引起的PCR增偏好性）及CNV分析（采用讀濃度法即read-depth method）4個(gè)步驟,。為顯示方便會生成散點(diǎn)圖,，當(dāng)點(diǎn)明顯在基線上部（增益+）或下部（—）時(shí)，即存在拷貝數(shù)變異,。Decipher,、Clinvar、UCSC等常用數(shù)據(jù)庫可用于檢索并解讀CNV, 其中Decipher數(shù)據(jù)庫記錄了每一例CNV的染色體位置,、純合與雜合情況,、致病性、表現(xiàn)型等信息,；Clinvar數(shù)據(jù)庫記錄了CNV所在的基因,、致病性等信息；UCSC數(shù)據(jù)庫則可以查看CNV是否位于基因的功能性區(qū)域,。
胚胎PGD服務(wù)結(jié)合了高通量測序技術(shù)，對囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,，并對家系樣本進(jìn)行捕獲測序和單核苷酸多態(tài)性分析（SNP）,，以獲得夫婦及先證者致病基因連鎖單倍型信息,，再根據(jù)胚胎樣本的測序信息判斷是否遺傳了父母親的致病單倍型，輔助臨床上選擇無致病基因攜帶或受遺傳病影響最小的胚胎進(jìn)行植入，阻斷家族性遺傳病的垂直遺傳,，提高遺傳病患者或攜帶者生育健康嬰兒的概率,，降低新生兒的出生缺陷率,。目前主要適用于夫婦雙方或一方核型異常的夫妻,；單基因遺傳病患者或攜帶者夫婦；有家族遺傳病史且明確致病位點(diǎn)的夫婦,；已生育過遺傳病患兒且欲通過輔助生殖生育的夫婦,。PGD基于SNP連鎖分析原理，根據(jù)不同的單基因病設(shè)計(jì)panel,，隨后進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲及高能量測序,，擴(kuò)增位于突變位點(diǎn)附近的短串連重復(fù)（STR）多態(tài)性標(biāo)記。與突變的等位基因連鎖的STR長度值可以通過PGD之前使用父本和母本基因組DNA的片段分析來確定,，且胚胎的基因型可以在PGD期間通過SNP連鎖分析來診斷,。除了通過限制長度多態(tài)性或微量測序的直接突變技術(shù)之外，使用與突變位點(diǎn)連鎖的多個(gè)STR標(biāo)記物有助于克服ADO導(dǎo)致的誤診問題,。確定胚胎的基因型后,，結(jié)合對23對染色體非整倍性進(jìn)行分析，為選擇健康胚胎提供可靠依據(jù),。
PGD的數(shù)據(jù)分析相較PGS的增加了變異位點(diǎn)分析及單體型分析,。變異位點(diǎn)分析主要是根據(jù)樣本基本組每個(gè)位點(diǎn)與參考基因組的比對情況，判斷該位點(diǎn)是否發(fā)生突變，從而確定該位點(diǎn)的基因型,；單體型分析則一般采用SNP單體型連鎖分析,，即以致病基因上下游SNP的整體組合來代表基因存在與否，通過識別一條包含致病基因的DNA鏈來代替單個(gè)基因位點(diǎn)的識別,，最大限度則是比對同一位點(diǎn)上父本,、母本及胚胎的基因型，將子代基因型的父源鏈及母源鏈區(qū)分,，判斷胚胎該位點(diǎn)2個(gè)堿基的來源的,。據(jù)此，如果已知致病基因在父源的某一條鏈上,，則可通過分析子代是否攜帶此鏈來判斷子代是否遺傳了父親的致病基因,。只要發(fā)現(xiàn)子代攜帶了致病鏈，即使在活檢細(xì)胞擴(kuò)增中父源致病基因擴(kuò)增為陰性,，也能輔助判斷出致病基因的存在,。
遺傳咨詢是PGD一個(gè)不可缺少的環(huán)節(jié)。在遺傳咨詢過程中,，生殖中心應(yīng)全面了解患者的生育情況及家族有無遺傳病,，通過全面了解患者夫婦雙方遺傳病發(fā)病情況，繪制家系圖譜,，必要時(shí)完成與妊娠結(jié)局相關(guān)的其他檢查,，包括男性精液分析、雙方染色體,、有生育意愿的女性宮腔鏡檢查；生殖中心應(yīng)告知患者PGD的過程,、采用方法,、技術(shù)的局限性及預(yù)期結(jié)果。知情同意書中應(yīng)包括機(jī)構(gòu)的PGD誤診率,，并告知患者其他選擇,，包括自然妊娠后產(chǎn)前診斷的選擇及面臨的結(jié)果。 PGD成功后需進(jìn)行產(chǎn)前診斷,，產(chǎn)前診斷檢測根據(jù)生殖中心提供的建議和檢測方式,，患者自己選擇是否檢測及檢測方式。目前產(chǎn)前診斷包括有創(chuàng)(絨毛,、羊水)和無創(chuàng)（超聲診斷,、母體外周血胎兒游離DNA）兩種方式。同時(shí),，在胎兒出生時(shí),，應(yīng)抽取臍帶外周血驗(yàn)證產(chǎn)前檢測的準(zhǔn)確性，并保證PGD的有效性。
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