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本文刊登于《中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志》2016年3期219-222頁 作者：劉東云，黃國寧 作者單位：重慶市婦產(chǎn)科醫(yī)院遺傳與生殖研究所,，重慶 400013 通訊作者：黃國寧,，電子信箱：[email protected] 1990年世界首例植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）試管嬰兒的出生標(biāo)志著人類輔助生殖技術(shù)的突破性進(jìn)展。近十年來,，隨著單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)及分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展,，植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)得到迅速發(fā)展及廣泛應(yīng)用。2008年P(guān)GD國際協(xié)會(huì)（PGDIS）公布的數(shù)據(jù)顯示,，可進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷的單基因疾病種類約170種,。目前國內(nèi)尚缺乏植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)規(guī)范，為此,，本文以“consensus”or “guideline”, and “PGD” or “PGS”為關(guān)鍵詞檢索了2010年至今的關(guān)于國外植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)規(guī)范或指南相關(guān)文獻(xiàn),，并就此解讀。 1 國際PGD指南概況 成立于2002年10月的PGDIS 2004年頒布了PGD技術(shù)指南（PGDIS, 2004）,。并于2008年修正了PGD操作流程及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保障指南,，就PGD實(shí)驗(yàn)室建立、標(biāo)本取材,、診斷技術(shù),、胚胎移植,、質(zhì)量控制與保障、遺傳咨詢與隨訪等提出了建議,。歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(huì)（ESHRE）PGD聯(lián)盟就PGD實(shí)驗(yàn)室的設(shè)立及相關(guān)的3項(xiàng)技術(shù)：DNA擴(kuò)增技術(shù),、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、胚胎活檢建立了相關(guān)指南,。2015年,，Tur-Kaspa等提出了用于HLA配型的PGD指南，有助于指導(dǎo)PGD技術(shù)在選擇與罹患血液系統(tǒng)疾病,、急需臍帶血干細(xì)胞（骨髓）移植患兒的父母選擇HLA配型符合的胎兒中的規(guī)范應(yīng)用,。作為高加索人群中最常見的單基因遺傳病，囊性纖維瘤在歐洲人群中的患病率為1/4000,，Girardet等2015年則提出了囊性纖維瘤PGD指南，可作為單基因病PGD技術(shù)指南參考,。這些指南有助于規(guī)范PGD技術(shù),，并建立符合中國國情的PGD技術(shù)規(guī)范和指南。 2 PGD實(shí)驗(yàn)室建立指南 PGDIS建議應(yīng)根據(jù)ESHRE Embryology Specail Interest Group 的推薦建立合理的IVF實(shí)驗(yàn)室及高效的PGD實(shí)驗(yàn)室,。PGD流程中包括胚胎培養(yǎng),、胚胎活檢、細(xì)胞固定,、細(xì)胞DNA擴(kuò)增,、熒光原位雜交、基因測序,、胚胎移植等諸多環(huán)節(jié),，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立充分的信息交流，并遵循嚴(yán)格,、一致的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),。所有實(shí)驗(yàn)室操作流程應(yīng)記錄在一本操作手冊(cè)上，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)及時(shí)更新操作手冊(cè),，并確保每一位相關(guān)工作人員掌握最新的操作流程,。這樣才能保證治療結(jié)果的一致性。PGD過程中,，胚胎活檢,、胚胎的獨(dú)立培養(yǎng)、根據(jù)PGD結(jié)果選擇可移植胚胎是最重要的3個(gè)環(huán)節(jié),，須雙人審核,。PGD實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能夠同時(shí)開展包括FISH和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的單細(xì)胞遺傳學(xué)分析與診斷技術(shù)。 因?yàn)闃O體活檢,、卵裂期胚胎活檢和囊胚活檢都可用于PGD,，所以PGD中心必須有經(jīng)過正規(guī)培訓(xùn)的胚胎學(xué)工作人員熟練掌握并長期操作上述技術(shù),，即使上述活檢技術(shù)不是在每一個(gè)PGD中心都常規(guī)開展。PGD實(shí)驗(yàn)室建立過程中應(yīng)格外注意避免外源性細(xì)胞或DNA污染活檢細(xì)胞,，外源性DNA污染包括來源于操作者導(dǎo)致的污染等,。嚴(yán)格遵循PCR實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范?；驍U(kuò)增前的操作應(yīng)在獨(dú)立的區(qū)域且在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行,，PGD分析應(yīng)能檢測出母源性及父源性DNA污染的可能性，否則存在較高的誤診風(fēng)險(xiǎn),?；顧z后的細(xì)胞應(yīng)在相鄰的獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞固定（用于FISH）或全基因組擴(kuò)增（用于PCR）。標(biāo)本的標(biāo)記和識(shí)別是一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié),，在細(xì)胞固定或轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管時(shí),、胚胎診斷及診斷后對(duì)應(yīng)胚胎這3個(gè)環(huán)節(jié)上必須經(jīng)過雙人審核與認(rèn)證。國內(nèi)外都有很多生殖中心將活檢后的標(biāo)本外送至特定的檢測公司或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行診斷,，此時(shí)必須在生殖中心與檢測實(shí)驗(yàn)室之間建立嚴(yán)格的標(biāo)本運(yùn)輸與接收,、標(biāo)記體系，同時(shí)應(yīng)明確雙方權(quán)責(zé),。生殖中心和檢測實(shí)驗(yàn)室之間應(yīng)就法律,、保險(xiǎn)和責(zé)任簽署正式合同。建議生殖中心和檢測實(shí)驗(yàn)室共同使用聯(lián)合知情同意書,。生殖中心進(jìn)行的細(xì)胞固定或轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管的操作需要得到檢測實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果認(rèn)可后方可施行臨床標(biāo)本檢測,。 3 胚胎活檢技術(shù)指南 可用于PGD的細(xì)胞來源包括卵子極體、卵裂期細(xì)胞,、囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞,。不同來源的細(xì)胞可進(jìn)行不同目的的PGD，極體活檢主要用于檢測卵子非整倍體及母源性遺傳病,，不能檢測父源性遺傳性疾病,，目前國內(nèi)幾乎沒有生殖中心采用極體活檢。卵裂期及囊胚細(xì)胞可用于幾乎所有的PGD,。 胚胎活檢可通過機(jī)械法,、化學(xué)法、激光法在透明帶開孔,。PGDIS建議只能在透明帶上開一個(gè)孔,，以避免細(xì)胞丟失或胚胎孵出時(shí)嵌頓于透明帶開孔處。應(yīng)避免開孔過大（>60μm）,、過度擠壓胚胎,、激光能量過高，上述操作均可能損傷胚胎,。 活檢培養(yǎng)基使用與胚胎培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基,，除了Ca2 ,、Mg2 外，其他物質(zhì)含量相同,，以避免胚胎休克,。活檢培養(yǎng)基中加入蔗糖有助于細(xì)胞皺縮,，從而縮小細(xì)胞體積,，便于從透明帶開孔出取出細(xì)胞?；顧z速度非常重要,，建議進(jìn)行胚胎活檢時(shí)由另一名胚胎學(xué)工作人員協(xié)助準(zhǔn)備及更換培養(yǎng)皿，以縮短胚胎暴露于培養(yǎng)箱外的時(shí)間,。理想的活檢時(shí)間是每個(gè)胚胎不超過1 min,。PGDIS強(qiáng)調(diào)生殖中心應(yīng)配備足夠的培養(yǎng)箱，以縮短胚胎活檢過程中胚胎暴露于培養(yǎng)箱外的時(shí)間,，減少開關(guān)培養(yǎng)箱次數(shù),，避免由此引起的溫度波動(dòng)。 胚胎活檢中操作者的經(jīng)驗(yàn)對(duì)PGD結(jié)果及IVF妊娠結(jié)局都具有十分重要的影響,。PGDIS推薦胚胎活檢操作者必須具備豐富的經(jīng)驗(yàn)并常規(guī)操作該技術(shù)。PGDIS推薦利用廢棄胚胎練習(xí)操作,，不斷提高操作技能,，并強(qiáng)調(diào)，不建議偶爾操作的人或經(jīng)驗(yàn)不足的人進(jìn)行胚胎活檢,。生殖中心有義務(wù)驗(yàn)證活檢過程不會(huì)影響胚胎發(fā)育潛能,。 針對(duì)卵裂球活檢，PGDIS推薦活檢的胚胎至少為5個(gè)細(xì)胞期以上,，只能取1個(gè)細(xì)胞,，避免取2個(gè)細(xì)胞?；顧z的細(xì)胞應(yīng)完整,，并有清晰可見的細(xì)胞核。較多文獻(xiàn)支持D3胚胎活檢可能影響胚胎發(fā)育潛能,。目前國內(nèi)外越來越多的PGD中心采用囊胚活檢取代卵裂期胚胎活檢,。 4 胚胎診斷技術(shù)指南 染色體異常的PGD可通過FISH及全基因組擴(kuò)增后的芯片或測序技術(shù)診斷。 4.1 針對(duì)FISH的PGD技術(shù)指南 使用甲酰胺,、冰乙酸可減少細(xì)胞固定后的信號(hào)重疊及相應(yīng)的誤診風(fēng)險(xiǎn),，減少細(xì)胞核丟失和DNA碎片化。固定過程中細(xì)胞漿破裂后不應(yīng)繼續(xù)加固定液,。雜交前須在相差顯微鏡下確認(rèn)并標(biāo)記細(xì)胞核,，并檢查胞漿是否去除干凈,，否則會(huì)影響雜交效果。細(xì)胞固定是一個(gè)技巧性強(qiáng)的操作,，可利用D2鼠胚練習(xí)細(xì)胞固定操作,。PGDIS推薦PGD前先通過正常或三體細(xì)胞株驗(yàn)證FISH探針,。FISH的雜交率應(yīng)在95%以上,。用于檢測非整倍體的FISH探針至少應(yīng)包括X、Y,、13,、15、16,、18,、21、22號(hào)染色體探針,，因?yàn)檫@些是自然流產(chǎn)胚胎中最常見的三體異常,。FISH用于染色體平衡易位患者的PGD時(shí)，使用的探針應(yīng)至少包括2個(gè)端粒探針和一個(gè)著絲粒探針,，或2個(gè)著絲粒探針和一個(gè)端粒探針,，這樣能檢測出所有的非平衡染色體組合，同時(shí)PGDIS推薦PGD前首先用攜帶者的淋巴細(xì)胞驗(yàn)證探針效果后再進(jìn)行臨床檢測,。 4.2 針對(duì)PCR的PGD技術(shù)指南 ESHRE PGD聯(lián)盟推薦基因擴(kuò)增前區(qū)域必須是獨(dú)立于IVF實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域,，在層流或?qū)恿鲀艋窒逻M(jìn)行擴(kuò)增前DNA標(biāo)本處理。嚴(yán)格遵循PCR實(shí)驗(yàn)室規(guī)范標(biāo)準(zhǔn),，必須施行單向工作流程,。因PGD中檢測DNA為微量DNA，所以在確保獨(dú)立分區(qū)內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增前的標(biāo)本處理,，一般不存在氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn),。但應(yīng)注意避免操作者導(dǎo)致的外源性DNA污染，所以擴(kuò)增前處理標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意操作者須穿隔離衣,、戴口罩,、帽子，以避免污染檢測標(biāo)本,。所有的耗材,，包括吸頭、試劑都應(yīng)無DNA及DNA酶,。為避免精子來源的污染,，針對(duì)PCR的PGD必須使用卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）方式授精，同理,，應(yīng)盡可能去除顆粒細(xì)胞,，以減少母源性污染,。胚胎活檢過程中，如果取材過程中細(xì)胞破裂,，建議更換活檢針,。活檢后的細(xì)胞在轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管前應(yīng)沖洗2遍,，以盡可能少的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管,。細(xì)胞完全裂解及充分變性是PCR的關(guān)鍵，堿性溶細(xì)胞液和蛋白酶K/十二烷基硫酸鈉都可得到理想的效果,。 PGDIS推薦首先利用口腔黏膜細(xì)胞,、淋巴細(xì)胞或丟棄、捐贈(zèng)的囊胚驗(yàn)證單細(xì)胞擴(kuò)增有效性,，達(dá)到以下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后再進(jìn)行臨床檢測：擴(kuò)增率不低于85%,；PCR擴(kuò)增時(shí)應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因及目標(biāo)基因鄰近的高度多態(tài)性標(biāo)記物，這樣可檢測到擴(kuò)增失敗和ADO,；利用多態(tài)性標(biāo)記物可檢測和避免外源性DNA污染,，并確保外源性DNA含量不超過5%方可進(jìn)行臨床檢驗(yàn)。推薦使用巢式或半巢式PCR,，或多重?zé)晒釶CR,。 PCR用于PGD臨床檢測時(shí)必須設(shè)立陰性和陽性對(duì)照，陰性對(duì)照應(yīng)包括最后一個(gè)胚胎活檢后的培養(yǎng)基,。為了降低等位基因脫扣（ADO, allele drop-out）風(fēng)險(xiǎn),，ESHRE推薦DNA擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)中應(yīng)包括致病基因，以及致病基因位點(diǎn)之外的,、相鄰的相關(guān)及不相關(guān)位點(diǎn)，通過高度多態(tài)性標(biāo)記物的分析,，可以判斷外源性DNA污染及ADO,，從而提高單基因病PGD準(zhǔn)確率。近年來越來越多的中心使用連鎖分析技術(shù)用于單基因病的PGD,，基因連鎖分析必須結(jié)合不育夫婦及先證者,、甚至不育夫婦雙親的DNA分析。 5 結(jié)果判斷與出具報(bào)告 所有報(bào)告應(yīng)以書面形式出具,，聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室可通過傳真或郵件發(fā)送書面報(bào)告,，細(xì)節(jié)可通過電話溝通。報(bào)告要求格式固定,、結(jié)果清晰,、界面友好。PGD報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)室名稱及信息,，包括實(shí)驗(yàn)室名稱,、地址,、聯(lián)系電話等；醫(yī)生信息,；報(bào)告日期,；報(bào)告名稱（疾病名稱 PGD）；檢測疾病及基因名稱,；夫婦姓名及出生日期,；標(biāo)本信息（標(biāo)本類型、取材日期,、收到日期,、檢測日期）；檢測方法,；檢測結(jié)果,；誤診率；檢驗(yàn)者及審核者簽名,；頁碼及總頁碼數(shù),。無論FISH或PCR結(jié)果，PGDIS均建議由兩名具備診斷資質(zhì)的人員分別審閱分析,，獨(dú)立出具診斷意見,，診斷一致時(shí)方可出具診斷報(bào)告。如果兩名診斷人員判斷的結(jié)果不一致,，應(yīng)重復(fù)檢測,，必要時(shí)重新活檢。在不能出具明確診斷報(bào)告時(shí),，應(yīng)充分告知病人,，并由患者知情選擇。建議在與患者討論P(yáng)GD結(jié)果前,，應(yīng)由生殖中心有資質(zhì)的專業(yè)人員認(rèn)真審查,。 6 遺傳咨詢與隨訪 遺傳咨詢是PGD的一個(gè)重要環(huán)節(jié)和內(nèi)容。遺傳咨詢中,，生殖中心應(yīng)全面了解患者的生育狀況,，并給予充分的遺傳咨詢，全面了解患者夫婦雙方遺傳病發(fā)病情況,，繪制家系圖譜,，必要時(shí)完成與妊娠結(jié)局相關(guān)的其他檢查，包括精液分析,、染色體,、宮腔鏡檢查。PGDIS推薦生殖中心應(yīng)告知患者PGD的過程、采用的方法,、技術(shù)的局限性及預(yù)期結(jié)果,。知情同意書中應(yīng)包括機(jī)構(gòu)的PGD誤診率，并告知患者其他選擇,，包括自然妊娠后產(chǎn)前診斷的選擇及面臨的后果,。其中誤診率數(shù)據(jù)的來源應(yīng)為生殖中心上一年臨床數(shù)據(jù)總結(jié)，包括臨床發(fā)生的PGD誤診（由產(chǎn)前診斷或產(chǎn)后新生兒基因,、染色體診斷證實(shí)）,，以及以未移植的胚胎再次重復(fù)分析的結(jié)果判斷的誤診率。PGDIS強(qiáng)烈推薦不適宜冷凍及移植的胚胎應(yīng)用于驗(yàn)證PGD結(jié)果,，通過再次對(duì)所有卵裂球再次檢測分析,，評(píng)估PGD誤診率。系統(tǒng)分析有助于判斷PGD的有效性,，并評(píng)估單細(xì)胞的誤診率,，PGDIS建議誤診率應(yīng)低于10%。 PGD后的隨訪是評(píng)估PGD有效性的關(guān)鍵,。隨訪的內(nèi)容包括著床率,、臨床妊娠率、臨床流產(chǎn)率及新生兒隨訪,，由于流產(chǎn)胚胎中大多數(shù)與胎兒染色體異常有關(guān),，所以應(yīng)對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)一步分析，從而評(píng)估PGD結(jié)果準(zhǔn)確性,。新生兒隨訪應(yīng)了解有無明顯或輕微的出生缺陷,，以評(píng)估胚胎活檢可能對(duì)子代的影響，必要時(shí)應(yīng)復(fù)查新生兒遺傳信息,。生殖中心和檢測中心應(yīng)就PGD后的隨訪及數(shù)據(jù)收集達(dá)成一致,。 PGD妊娠后是否需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷，目前國內(nèi)大多數(shù)生殖中心持支持觀點(diǎn),，PGDIS也建議所有PGD妊娠后患者行產(chǎn)前診斷,，但PGDIS建議應(yīng)向患者提供所有可供選擇的產(chǎn)前診斷方式信息，包括絨毛取材,、羊水取材,、超聲診斷及無創(chuàng)產(chǎn)前診斷,，如胎兒游離DNA檢測,。對(duì)于拒絕接受產(chǎn)前診斷的患者，應(yīng)在分娩時(shí)抽取臍帶血驗(yàn)證染色體,、基因結(jié)果,，為總結(jié)PGD效率提供真實(shí)有效的數(shù)據(jù)。 值得注意的是,，指南的目的是促進(jìn)PGD中心提供更好的醫(yī)療服務(wù),，而不是以保證醫(yī)療結(jié)果為目的而制定的,。指南不能涵蓋所有操作或檢測，也不能排除可能獲得相同結(jié)果的其他操作或檢測,。醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)自己的專業(yè)判斷來決定優(yōu)先選擇的操作或檢測,。要注意指南出版的時(shí)間，并關(guān)注指南頒布之后的文獻(xiàn)和科學(xué)研究報(bào)道,。
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