基于NGS平臺的BRCA檢測對醫(yī)生朋友距離很近又似乎很遠(yuǎn)：臨床實踐中檢測訴求很明確,，但檢測過程像個黑匣子玄之又玄,，讓不少人對檢測望而生畏。BRCA基因本身有什么特點,？對應(yīng)于檢測有哪些合適的方法,？流程有哪些關(guān)鍵步驟？哪些樣本可用于檢測,？遺傳解讀需要達(dá)到什么水平才能保障結(jié)果的準(zhǔn)確性,？為什么體細(xì)胞突變檢測目前那么少見？今天就來深入八一八,，解答B(yǎng)RCA檢測中常見的疑惑,。

1. BRCA1和BRCA2基因介紹

BRCA1和BRCA2是最早發(fā)現(xiàn)的直接與遺傳性乳腺癌有關(guān)的兩個基因。作為抑癌基因,，兩者在調(diào)節(jié)細(xì)胞復(fù)制,、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長方面起著重要作用,。BRCA1/2基因序列很長,。具體來說，BRCA1長81.2kb,，由22個編碼外顯子組成,，轉(zhuǎn)錄形成5.7kb的mRNA。BRCA2長84.2kb,，由26個編碼外顯子組成,，mRNA長為11kb。

根據(jù)BIC數(shù)據(jù)庫（Breast Cancer Information Core, http://research.nhgri./bic/）,，BRCA1和BRCA2基因目前已報道的變異類型包括無義突變,、移碼突變、非移碼插入,、非移碼缺失,、錯義突變、同義突變,、剪接位點突變,，以及大片段的缺失或重排等，涉及到近4000個變異位點,，而且這些突變分散遍布于各個外顯子,，沒有證據(jù)表明存在突變熱點區(qū)域,，只存在少數(shù)幾個相對高頻的變異位點。若用傳統(tǒng)的Sanger測序,、qPCR方法或MLPA等對BRCA1/2整個基因進(jìn)行檢測,，都不能一次性檢測BRCA1和BRCA2基因的所有變異類型，且需要耗費大量的時間并且價格不菲,。相比之下,，高通量測序技術(shù)-二代測序技術(shù)以其更為高效快速且能一次性對BRCA1和BRCA2基因所有外顯子及鄰近上下游區(qū)域內(nèi)的變異同時進(jìn)行檢測,，以更高性價比的優(yōu)勢脫穎而出,，成為BRCA1/2基因檢測市場的主力軍。

2. BRCA胚系突變檢測流程

利用二代測序技術(shù)開展BRCA突變篩查檢測,，其流程復(fù)雜且專業(yè)性強(qiáng)（如下圖1）,，對工作人員專業(yè)技術(shù)能力和檢測流程的技術(shù)操作、質(zhì)量控制的要求高,。

圖1. BRCA胚系突變篩查檢測流程

在實驗室人員能力方面,，專業(yè)的技術(shù)人員是檢測結(jié)果準(zhǔn)確的重要保障。需要對不同方向的技術(shù)人員分別進(jìn)行專業(yè)的臨床基因擴(kuò)增檢驗?zāi)芰?、生物信息分析能力和遺傳解讀能力等培訓(xùn),，技術(shù)人員獲得相應(yīng)的上崗證和資格證書后方可進(jìn)行相關(guān)操作執(zhí)行。

在檢測流程方面,，實驗室收到檢測樣本后,，采用標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA。通常有2種方法構(gòu)建測序文庫：一種是利用超聲波儀將基因組DNA打斷,，進(jìn)行DNA建庫,。再利用定制探針與標(biāo)記好的患者DNA文庫雜交，雜交結(jié)束后進(jìn)行洗滌和洗脫反應(yīng),，再經(jīng)PCR擴(kuò)增構(gòu)成測序文庫,；另一種是設(shè)計BRCA基因特異的引物，用多重PCR的方法把BRCA基因上感興趣的區(qū)域擴(kuò)增,，然后進(jìn)行加接頭,、純化等反應(yīng)，構(gòu)建測序文庫,。測序文庫質(zhì)控合格后利用高通量測序儀讀出原始測序數(shù)據(jù),。測序完成后，數(shù)據(jù)分析流程見下圖2,。

圖2. 信息分析流程

首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測序質(zhì)量評估,，去除低質(zhì)量和接頭污染的“噪音”數(shù)據(jù)，然后將得到的無噪聲的數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比對,?；诒葘Y(jié)果,，進(jìn)行變異分析。最后,，對檢測到的變異參考若干數(shù)據(jù)庫及查閱文獻(xiàn)進(jìn)行臨床意義解讀,。

整個檢測流程每一個環(huán)節(jié)都需要設(shè)置相應(yīng)的技術(shù)操作規(guī)范，嚴(yán)格遵照技術(shù)操作程序執(zhí)行,，并開展室內(nèi)質(zhì)量控制,，參加國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心組織的室間質(zhì)量評價。國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心于2015年10月首次組織開展了全國腫瘤診斷與治療高通量測序檢測室間質(zhì)量評價測評活動,。此次測評活動分胚系突變和體細(xì)胞突變兩個部分,，胚系突變的合格率為84.1%，100%正確的實驗室77.3%,；體細(xì)胞突變的合格率僅51.2%,，全對的實驗室僅占16.7%。對于現(xiàn)今活躍的腫瘤診斷與治療高通量測序檢測市場,，這無疑也敲響了警鐘,，呼吁整個市場的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化。

此外,，由于整個檢測流程繁瑣復(fù)雜,，操作步驟繁多，為保障檢測結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性,，有臨床意義的位點（致病和疑似致病的突變）都必須經(jīng)過區(qū)別于NGS平臺的另一平臺（如,，Sanger和/或qPCR等）進(jìn)行驗證。在經(jīng)歷了二十幾步嚴(yán)格質(zhì)量把控環(huán)節(jié)后,，一份完整由專業(yè)解讀人員撰寫的BRCA基因檢測報告才會到達(dá)醫(yī)生手中,，為患者提供準(zhǔn)確的基因參考信息。

介紹完BRCA基因檢測的整體流程,，下面我們著重針對醫(yī)生朋友需要接觸到的兩個環(huán)節(jié),，樣品收集和報告解讀進(jìn)行介紹。

3. 樣品收集

BRCA基因檢測的過程中,，最基本的要素是樣本的可靠性,。只有從最初保證樣本質(zhì)量以及準(zhǔn)確的臨床資料，才能獲得最為精準(zhǔn)的基因檢測結(jié)果,。下面詳述BRCA基因檢測采樣時的注意事項,。

首先，醫(yī)生需要與患者充分溝通,，在患者充分理解基因檢測的價值,、必要性并認(rèn)可基因檢測的情況下，方可進(jìn)行進(jìn)一步的填寫表單（包括申請單與知情同意書）以及采樣。申請單必須要包括受檢者姓名,、年齡,、性別、民族,、籍貫,、個人疾病史、家族疾病史等,，以避免后期樣本混淆的可能,，同時對于部分特殊、具有家族史的成員,，出現(xiàn)較罕見的基因突變時信息也便于及時反饋給送樣醫(yī)生,，為患者提供更為嚴(yán)格準(zhǔn)確的檢測結(jié)果以及更為科學(xué)的進(jìn)一步治療方案。知情同意書的意義在于給患者更為詳實的檢測介紹,，進(jìn)一步理解基因檢測的內(nèi)容與意義,，規(guī)避可能存在的倫理風(fēng)險,。

其次，采樣流程,。過程包括樣本采集與樣本標(biāo)記,。BRCA基因檢測多采用外周血樣本采集，少數(shù)會提供唾液,、DNA樣品,。

對于采集后的樣本，在采集管上貼上樣本唯一條碼,，并注明受檢者姓名,、年齡等信息；樣本交接單上必須標(biāo)有受檢者姓名或入庫編號,、采樣日期,，確保信息與申請單一致，以避免不必要的混淆可能,。為保證運輸過程樣品的保護(hù),，請選擇專業(yè)的物流機(jī)構(gòu)并嚴(yán)格按照要求完成。

4. 遺傳報告解讀流程

遺傳報告解讀也具有一套嚴(yán)格的流程,。原則上均以美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）頒布的基因變異解讀和指南為解讀標(biāo)準(zhǔn),，首先利用公共和本地突變數(shù)據(jù)庫對變異頻率進(jìn)行過濾。經(jīng)過對功能預(yù)測分析軟件結(jié)果,、數(shù)據(jù)庫記錄,、文獻(xiàn)研究報道綜合考慮，并結(jié)合臨床表型，專業(yè)遺傳報告解讀人員會做出數(shù)據(jù)分析和解讀,。遺傳分析解讀最終需要對篩選出來的突變進(jìn)行判定,，按照美國國立衛(wèi)生院NIH的分類標(biāo)準(zhǔn)，遺傳性腫瘤易感突變分為五類,，致病突變,、疑似致病突變、意義未明突變,、疑似良性突變及良性多態(tài)性,。解讀報告除了對突變進(jìn)行健康等級分類外，也會為醫(yī)生及患者提供FDA批準(zhǔn)上市針對BRCA突變靶向藥物相關(guān)的信息（如針對BRCA基因突變的晚期卵巢癌患者治療,，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市的阿斯利康的奧拉帕利（Olaparib, 商品名 Lynparza）,。嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化解讀流程以及具有資質(zhì)的專業(yè)遺傳信息解讀人員都是遺傳報告解讀必不可少的部分，解讀人員需要具備遺傳學(xué),、醫(yī)學(xué)或藥學(xué)專業(yè)背景,，并且經(jīng)過專業(yè)的遺傳信息解讀培訓(xùn)以及實際解讀經(jīng)驗，才能勝任這一工作,。

5. BRCA體細(xì)胞突變檢測現(xiàn)況

在乳腺癌,、卵巢癌中檢測到的BRCA 1/2 突變，其中20%左右是由于體突變引起,。體細(xì)胞突變的檢測需要正常組織做對照,，常用血細(xì)胞做對照（如TCGA 癌癥研究）。研究發(fā)現(xiàn),，體細(xì)胞突變與胚系突變的卵巢癌,，乳腺癌病人在生存、預(yù)后方面沒有明顯的差異,，并且都可以用奧拉帕利進(jìn)行治療,。但是相對于胚系突變，體細(xì)胞突變檢測難度大些,。檢測的難度和準(zhǔn)確性主要受樣本類型,、癌癥細(xì)胞含量以及突變比例（具有BRCA 1/2 體細(xì)胞突變的癌細(xì)胞占所有癌細(xì)胞的比例）等影響。因此,，針對BRCA基因體細(xì)胞突變的檢測技術(shù)還在完善中,。

供稿人員：華大基因高爽、李世勇,、李紅梅,、曾憲一

阿斯利康整理返回搜狐，查看更多