文章信息

文獻(xiàn)標(biāo)題：SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation
發(fā)表時(shí)間：2018.10.22
發(fā)表雜志：Genome Biology（IF=10.806）
原文鏈接：https://genomebiology./articles/10.1186/s13059-018-1547-5

摘要

在一些重要的生物學(xué)問(wèn)題中,，需要對(duì)單細(xì)胞中的蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。這篇文章中,，作者提出了根據(jù)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行識(shí)別的方法——SCoPE-MS ,，并在小鼠正在分化的胚胎干細(xì)胞中定量了超過(guò)一千種蛋白質(zhì)。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提出了利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)細(xì)胞類(lèi)型定義的新方法,，并能推斷細(xì)胞類(lèi)型與特定的蛋白質(zhì)豐度之間的潛在關(guān)系,。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組之間的對(duì)比分析表明，mRNA和蛋白質(zhì)水平之間存在共變關(guān)系,，而許多基因能在mRNA和蛋白質(zhì)水平發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用,。

背景介紹

建立在細(xì)胞層面的差異分析，是理解人體正常生理活動(dòng),，解決腫瘤免疫,、干細(xì)胞療法等問(wèn)題的關(guān)鍵，這需要對(duì)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行量化分析,。然而,，過(guò)去對(duì)哺乳動(dòng)物單細(xì)胞蛋白質(zhì)的定量方法停留在免疫成像和測(cè)定抗體蛋白這兩種研究方法。免疫熒光成像技術(shù)有效,，但只限于對(duì)細(xì)胞中的一些蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,，并會(huì)在圖像中產(chǎn)生偽影。建立在抗體蛋白上的檢測(cè)方法在近幾年有了很大的突破和發(fā)展,，但仍然存在一些技術(shù)方面的缺陷,。

另一方面，作者提到了應(yīng)用液相色譜法 (liquid chromatography) 和串聯(lián)質(zhì)譜法(tandem mass spectrometry)能在bulk樣本中對(duì)幾千種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,，并推斷這種方法沿用在單細(xì)胞中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的合理性,。作者發(fā)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞中主要蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)超過(guò)50000，而現(xiàn)在的質(zhì)譜分析儀器能夠?qū)Ψ肿拥纳习賯€(gè)拷貝數(shù)進(jìn)行定量,。因此,，只要能夠從單細(xì)胞中得到1%的蛋白質(zhì)拷貝進(jìn)行質(zhì)譜分析，便能進(jìn)行精準(zhǔn)的定量,。

SCoPE-MS的技術(shù)方法

首先,，作者提出SCoPE-MS需要解決兩個(gè)重要的技術(shù)問(wèn)題：

• 1）在對(duì)單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到用于質(zhì)譜分析的載體過(guò)程中，如何最小化提取過(guò)程中蛋白質(zhì)的損失,？

• 2）如何實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)單細(xì)胞樣本中的肽分子進(jìn)行識(shí)別和定量,？

對(duì)于第一個(gè)問(wèn)題,，作者利用人工方法在顯微鏡下分離存活的單細(xì)胞，并通過(guò)聲波的方法將細(xì)胞進(jìn)行裂解(圖a),。過(guò)去使用化學(xué)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,，需要對(duì)使用的化學(xué)藥劑進(jìn)行清除，而這種方法會(huì)間接造成單細(xì)胞中蛋白質(zhì)的損失,。然后,，從細(xì)胞的裂解產(chǎn)物中提取的蛋白質(zhì)在90度時(shí)快速變性，并在45度中利用胰酶進(jìn)行消化,。同時(shí),，SCoPE-MS通過(guò)構(gòu)建載體細(xì)胞的形式運(yùn)輸?shù)鞍住］d體細(xì)胞能夠有效減少由于蛋白質(zhì)表面的黏附作用造成的蛋白質(zhì)流失,。

對(duì)于第二個(gè)問(wèn)題,，作者采取的方法是串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)進(jìn)行定量蛋白分析。這項(xiàng)技術(shù)可以對(duì)一次實(shí)驗(yàn)中多個(gè)樣本進(jìn)行全蛋白組定量分析,。在單細(xì)胞層面,，TMT能夠通過(guò)標(biāo)記每個(gè)樣本中的肽段后對(duì)肽段進(jìn)行識(shí)別和定量。

對(duì)于TMT標(biāo)記肽段的定量依賴(lài)于報(bào)告離子(reporter ion, RI),，RI的表達(dá)水平能夠反映肽段的豐度和噪聲的分布,。作者通過(guò)計(jì)算信噪比，得出RI的強(qiáng)度在非空閑的信道中與標(biāo)記的肽段數(shù)量成比例,，而在空閑的信道中強(qiáng)度普遍較低的結(jié)論,。

為了檢驗(yàn)和評(píng)估SCoPE-MS的功能，作者通過(guò)將SCoPE-MS定量單細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法和bulk樣本定量蛋白的方法進(jìn)行對(duì)照分析(圖b-e),。結(jié)果表明,，SCoPE-MS盡管含有更多噪聲，但定量結(jié)果的精確度和重現(xiàn)度更高,。

應(yīng)用SCoPE-MS研究分化中的胚胎干細(xì)胞

作者通過(guò)SCoPE-MS這種方法,，對(duì)小鼠的胚胎干細(xì)胞在分化過(guò)程中的單細(xì)胞層面的蛋白質(zhì)表達(dá)的異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了量化分析(圖a-d)。作者從胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液去除白細(xì)胞抑制因子(LIF), 并進(jìn)行懸浮培養(yǎng),。圖a反映的是在去除LIF后3,、5、7天的細(xì)胞中根據(jù)蛋白質(zhì)表達(dá)計(jì)算協(xié)方差相關(guān)系數(shù)并進(jìn)行層次聚類(lèi)的結(jié)果,，揭示了胚胎干細(xì)胞各分化階段的每個(gè)group之間的蛋白質(zhì)表達(dá)關(guān)聯(lián)度的差異,。圖a中三張圖的每一行或者每一列為一種蛋白質(zhì)關(guān)于所有蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)向量。然后,，作者分別對(duì)day3,、day5、day8兩兩進(jìn)行關(guān)聯(lián)向量的關(guān)聯(lián)度分析,，圖b反映了day5和day8之間的關(guān)聯(lián)向量的平均關(guān)聯(lián)度最高,，說(shuō)明day5和day8之間的蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)向量的情況更加相似,。

圖c是對(duì)細(xì)胞中的核糖體蛋白的表達(dá)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果。從heatmap的結(jié)果能夠反映核糖體蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)度要顯著高于其他蛋白表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)度(利用圖c和圖a中的三張圖進(jìn)行比較可以得出結(jié)論),。圖d是根據(jù)GO,，分別對(duì)每一種特定功能對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)group中的蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)量的關(guān)聯(lián)度分析,。

作者對(duì)不同分化階段的胚胎干細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析之后,，進(jìn)行了主成分分析。作者的分析過(guò)程也就是將SCoPE-MS與一系列常規(guī)的組學(xué)的統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合,。作者首先對(duì)比了在bulk樣本中識(shí)別的不同蛋白質(zhì)豐度的數(shù)量分布和單細(xì)胞樣本中對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的分布情況(圖a),。由此可見(jiàn)，在單細(xì)胞中蛋白質(zhì)豐度總體要高于bulk樣本,。

圖b是作者利用主成分分析day3,、day5、day8的共計(jì)190個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,。主成分分析的主要目的在于對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行降維,，選取三個(gè)主要成分能夠?qū)?90個(gè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行區(qū)分和可視化。圖c是作者所選取的3個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的方差解釋度和其他的相關(guān)信息,。圖d-e展現(xiàn)的是作者對(duì)day8的細(xì)胞分別選取不同的兩個(gè)維度對(duì)兩類(lèi)功能的相關(guān)蛋白質(zhì)group的表達(dá)水平進(jìn)行可視化,。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的對(duì)比分析

最后，作者沿用了多組學(xué)的一貫套路,，將單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析,。

圖a是作者利用Klein在2015提供的胚胎干細(xì)胞不同分化階段的scRNAseq數(shù)據(jù)，對(duì)mRNA的表達(dá)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析,。圖b是作者提供的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果,。作者通過(guò)結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)，可以觀察基因是否能夠在mRNA和蛋白質(zhì)水平共同表達(dá),。圖c是作者利用圖a和圖b中的層次聚類(lèi)結(jié)果,，比較單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的overlap情況。圖d是蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)度和它們相對(duì)應(yīng)的mRNA的關(guān)聯(lián)度之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果,。圖e反映了不同功能對(duì)應(yīng)的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)協(xié)同性的情況,，說(shuō)明核糖體相關(guān)的蛋白質(zhì)(RPS和RPL)表達(dá)具有的協(xié)同性更高。

總結(jié)

選擇這篇文章的原因是近期我對(duì)單細(xì)胞多組學(xué)的有關(guān)研究的關(guān)注,。過(guò)去有幾年的時(shí)間內(nèi),，我們關(guān)注的重心都是只停留在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組層面，但是蛋白質(zhì)是作為生物體行使主要功能的基本單位,，對(duì)我們認(rèn)識(shí)生命的基本活動(dòng)和病理變化均有重要意義,。但是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)距離發(fā)展成熟還有相當(dāng)遙遠(yuǎn)的一段距離。前段時(shí)間我看到《Nature Methods》上的一篇文章《Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics》,，于是我產(chǎn)生了回溯近兩三年單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的興趣,，我也會(huì)在后面更新一系列和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)的文章,。

這篇文章和很多單細(xì)胞領(lǐng)域的文章一樣，從介紹技術(shù),，并結(jié)合技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行分析,。但是由于這篇文章是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)開(kāi)端，因此存在著一系列缺陷,，包括在文章的后半段也僅僅停留在一些比較簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)方法和常規(guī)的思路上,。盡管如此，這篇文章在開(kāi)篇提出的技術(shù)方法,，即結(jié)合液相色譜法和串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)單細(xì)胞層面的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的方法具有開(kāi)創(chuàng)性的意義,。這項(xiàng)技術(shù)方法在第二代產(chǎn)品(SCoPE2)中有了很大的改進(jìn)，無(wú)論是樣本的制備,，還是質(zhì)譜分析方法都有了很大的改進(jìn),。