言歸正傳,，十一講中將我們主要講了如何將下機(jī)數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組中,。但是很多人對(duì)比對(duì)結(jié)果卻是一頭霧水。那我們現(xiàn)在來了解一下Sam格式的比對(duì)結(jié)果吧,！

比對(duì)工具到現(xiàn)在已經(jīng)多如牛毛了,，見列表： https://en./wiki/List_of_sequence_alignment_software 。但是能被大多數(shù)人熟知的,，就是bowtie和bwa（我們?cè)谑恢v中用的才是bwa）,，它們把測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組之后，都會(huì)生成一個(gè)sam格式的文件,。隨后的大部分分析都是基于sam格式進(jìn)行的分析,，雖然Jimmy多次強(qiáng)調(diào)這些基礎(chǔ)知識(shí)的重要性需要大家私下自學(xué)。但是由于這個(gè)sam文件實(shí)在是太重要了?。,。∷裕坏貌挥H自抽出一講來說說它,，后面也會(huì)基于此寫十多篇文章：

因?yàn)檫@個(gè)是基礎(chǔ),，如果你后面的十幾篇有不理解的，請(qǐng)回頭來再仔細(xì)看看sam文件的定義,！

當(dāng)然,，不僅是這些分析是基于對(duì)sam文件的理解，我只是舉幾個(gè)例子,，大家千萬要熟練使用sam格式的比對(duì)結(jié)果,，最權(quán)威的定義見：https://samtools./hts-specs/SAMv1.pdf

記住，我們的雙端測(cè)序的數(shù)據(jù),，一個(gè)paired reads,，有左右兩端兩條reads,，所以在sam文件里面會(huì)有且只有兩條記錄,，除非你設(shè)置特殊參數(shù)，允許輸出多比對(duì)情況,。

上面是一個(gè)典型的PEreads輸出的sam比對(duì)結(jié)果,，反正必須要有的就是下面11列，其中第3和第7列,，可以用來判斷某條reads是否比對(duì)成功到了基因組的染色體,，左右兩條reads是否比對(duì)到同一條染色體。而第1,，10,，11列可以提取出來還原成我們的測(cè)序數(shù)據(jù)fastq格式的。第9列是我們建庫(kù)的時(shí)候打斷的片段長(zhǎng)度,，本次是PE150的數(shù)據(jù),，打斷成350bp，所以這里應(yīng)該是350個(gè)字符左右,，但如果是RNA-seq數(shù)據(jù),，就不一樣了。

其中第二列flag是比較反人類的,，一般人用不了二進(jìn)制,，有網(wǎng)頁(yè)可以幫助你：http://picard./explain-flags.html。我們的sam里面第二列是下面這些二級(jí)制轉(zhuǎn)為十進(jìn)制后的和,！

然后第6列CIGAR是比較重要的,，解釋如下，其中M并不是說match,，所以我們的PE 150的reads,，大部分都會(huì)是150M，但是并不代表著跟參考序列一模一樣。其中S/H是比較特殊的,，很難講清楚,，但是大部分情況下用不到。（soft-clipping堿基是指一條reads未匹配上當(dāng)前基因組位置的部分,，如果有多個(gè)reads在這種情況并且這些reads的soft-clipping堿基都能夠比對(duì)在基因組另一位置,，那么就可能存在SV）

第5列，比對(duì)結(jié)果的質(zhì)量值,，也是因工具而異,。

 a. Match score: Score awarded for a base in a sequence matching a base in another sequence

 b. Alignment score: Cumulative score of the bases of a sequence matching the bases of another sequence (more this score, better the alignment, if all else equal)

 c. Mapping Quality score: Probability that the shorter sequence is mapped to the right spot on the longer sequence.

如果定義某條reads比對(duì)的質(zhì)量值是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，我也沒辦法說清楚,，感興趣的朋友可以去查看 http://biofinysics./2014/05/how-does-bowtie2-assign-mapq-scores.html

但是需要記住,，質(zhì)量值越高這個(gè)比對(duì)越可信，如果質(zhì)量值為0,，可能是該序列在參考基因組有多種定位的可能性,。

最后，一般來說,，sam文件肯定是大于11列的,，后面多余的列是各種各樣的 tag。而且只要是你開發(fā)了一個(gè)比對(duì)工具,，你就可以定義一堆tag,，這個(gè)并沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)閟am文件的定義就是前面的11列,，后面的tag是隨心所欲的,！

但是一般RG代表著你的sam文件比對(duì)來自于哪個(gè)樣本的fastq程序結(jié)果。NM這個(gè)tag是編輯距離,，大概就是你的reads如果想轉(zhuǎn)變成參考基因組,，需要改變多少個(gè)堿基，如果編輯距離是0才說明你的這個(gè)150bp長(zhǎng)度的序列跟參考基因組一模一樣,。

MD這個(gè)tag里面寫明了,，你的序列跟參考基因組不同在哪里，比如下面的截圖里面的,，我的某個(gè)位點(diǎn)相比參考基因組來說,，就變成了G，而其余的堿基都是一樣的,。

AS和XS在兩個(gè)標(biāo)簽貌似沒什么用,，以后再說吧。

如果你用的bowtie或者h(yuǎn)isat等其它比對(duì)工具,，還會(huì)有更多的稀奇古怪的tag,，學(xué)無止境呀,！

文：Jimmy、吃瓜群眾

圖文編輯：吃瓜群眾