1 測序方法分類

2 基因組測序

2.1 全基因組測序

• 大型全基因組測序
  對人類,、植物或動(dòng)物基因組等大型基因組（＞5 Mb）測序,，可為疾病研究和群體遺傳學(xué)提供有價(jià)值的信息,。
• 小型全基因組測序
  小型基因組測序（≤ 5 Mb）涉及對細(xì)菌,、病毒或其他微生物的整個(gè)基因組進(jìn)行測序，并將序列與已知參考序列進(jìn)行比較,。小型微生物基因組的測序?qū)残l(wèi)生領(lǐng)域的食品檢測,、傳染性疾病監(jiān)控、分子流行病學(xué)研究和環(huán)境宏基因組學(xué)很有用,。
• 從頭測序
  從頭測序是指在沒有任何參考序列的情況下對某個(gè)未知基因組進(jìn)行測序,。NGS可以對任何物種進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的特征分析。
• Phased測序
  Phased測序（即基因組phasing）能區(qū)分同源染色體上的等位基因,，獲得全基因組單倍型信息,。此信息通常對遺傳病的研究很重要。

2.2 全外顯子組測序

摘自“納昂達(dá)科技”公眾號《全外顯子捕獲那些事》—https://mp.weixin.qq.com/s/wZqmMc0WXaAy0AYkLCeDAg
外顯子組測序是一種廣泛采用的靶向測序方法,。全外顯子測序（Whole Exome Sequencing, WES）僅對人基因組約2%的區(qū)域測序,，便可覆蓋絕大多數(shù)基因的編碼序列和>99%（臨床基因組資源庫，ClinGen）疾病相關(guān)區(qū)域,。借助WES可檢測基因的點(diǎn)突變,、小片段插入缺失、基因重排及拷貝數(shù)變異等信息,。

2.3 靶向基因組測序

采用靶向測序,，一組基因或基因組區(qū)域可被分離出來并對其進(jìn)行測序。靶向測序讓研究人員能夠?qū)r(shí)間,、費(fèi)用和數(shù)據(jù)分析集中在感興趣的特定區(qū)域,，并在更高的覆蓋度水平上開展測序。在目標(biāo)富集中,，感興趣的特定區(qū)域通過與生物素標(biāo)記的探針雜交而被捕獲,，之后通過磁性分離,。擴(kuò)增子測序采用高度多重PCR 寡核苷酸組對感興趣的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和純化。

• 雜交捕獲技術(shù)
  通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)片段互補(bǔ)的生物素化探針,，使其與含目的基因的片段進(jìn)行雜交,，以達(dá)到將目的基因片段富集后進(jìn)行高通量測序的目的。根據(jù)支持物的不同,，探針雜交捕獲技術(shù)分為液相雜交與固相雜交兩種,。固相雜交由于其在花費(fèi)與操作上的劣勢，已基本被淘汰,；液相雜交是在溶液中,，目標(biāo)片段和帶有生物素標(biāo)記的探針直接雜交，然后利用被鏈霉親和素包裹的磁珠對雜交了生物素探針的片段進(jìn)行吸附,。洗去游離DNA后,，將富集得到的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建高通量測序文庫,。
  
  

  雜交捕獲流程
• 擴(kuò)增子捕獲技術(shù)
  擴(kuò)增子捕獲測序技術(shù)是一種目標(biāo)區(qū)域高通量測序技術(shù),，利用特異性引物來對感興趣的DNA區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成高度富集的DNA庫,，將PCR產(chǎn)物純化后再進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序,。
  
  

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• 富集方法對比
  
  

  捕獲方法對比

2.4 文庫構(gòu)建試劑盒

3 轉(zhuǎn)錄組測序

3.1 RNA分類

Boivin V, Faucher‐Giguère L, Scott M, et al. The cellular landscape of mid‐size noncoding RNA[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, 2019, 10(4): e1530.

Malek E, Jagannathan S, Driscoll J J. Correlation of long non-coding RNA expression with metastasis, drug resistance and clinical outcome in cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(18): 8027.

3.2 全轉(zhuǎn)錄組測序（Total RNA）

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有轉(zhuǎn)錄本的總和，包括mRNA和所有的non-coding RNA,。全轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用RNA-Seq技術(shù),，通過構(gòu)建兩種文庫（small RNA文庫和去rRNA的鏈特異性文庫），對四種RNA（miRNA,，lncRNA,，mRNA，circRNA）的表達(dá)及調(diào)控關(guān)系進(jìn)行分析,。

3.3 轉(zhuǎn)錄組測序（mRNA）

轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）是指細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合,，包括mRNA、non-coding RNA等,。轉(zhuǎn)錄組具有時(shí)空特異性,，通過轉(zhuǎn)錄組能夠從轉(zhuǎn)錄水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)以及疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理,。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）是利用高通量測序獲取轉(zhuǎn)錄組中mRNA的信息,，通過分析基因表達(dá)量以及結(jié)構(gòu)的變化，挖掘致病機(jī)制,，闡明發(fā)病機(jī)理,，指導(dǎo)用藥以及藥物研發(fā)。

3.3.1 干擾rRNA去除

由于直接對樣本的total RNA進(jìn)行測序?qū)?huì)產(chǎn)生大量無用rRNA冗余信息,，因此在提取到total RNA之后,，需要對其中的背景RNA進(jìn)行去除（如占total RNA約80%-90%的rRNA）,，去除背景干擾的方法有兩種：
1）“+”法，也即poly A富集法
該方法的原理是基于真核生物的mRNA及部分長鏈非編碼RNA（lncRNA）均帶有poly A尾巴,，但是該方法具有3’末端偏好性,，適用于低RNA樣本量時(shí)的rRNA去除，另外需要注意的是,，不適用于RNA降解較為嚴(yán)重的的樣本（如FFPE）,。

• oligo dT引物富集
  引物捕獲由于特異性差和富集度低，因此在實(shí)際操作中還是以磁珠純化的方法較多

• oligo dT磁珠捕獲

  
  
  

  oligo dT磁珠捕獲

2）“-”法,，rRNA直接去除法
針對不含有poly A尾的轉(zhuǎn)錄本,，以及存在部分降解的total RNA（如FFPE）

Sorek R, Cossart P. Prokaryotic transcriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity[J]. Nature Reviews Genetics, 2010, 11(1): 9-16.

• rRNA特異探針雜交消減法
  通過使用與 rRNA 互補(bǔ)的DNA寡核苷酸探針與總 RNA 樣品雜交去除 16S 和 23S rRNA；然后使用RNase H去除DNA-rRNA雜交鏈的rRNA,，隨后用DNase I去除DNA probes,。如Ribo-Zero rRNA removal kit (Epicentre)；

  
  
  

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• 選擇性引物擴(kuò)增法

  
  
  

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• 5’單核苷酸依賴的外切酶處理法
  mRNA-ONLY prokaryotic mRNA isolation kit (Epicentre)

  
  
  

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• 依賴于雙鏈特異核酸酶的cDNA均一化法
  這種方法從真核生物借鑒而來, 是在 cDNA 水平上降低 rDNA 和 tDNA 所占的比例, 在原核生物中應(yīng)用的還不多,。相應(yīng)的試劑盒主要有trimmer-direct cDNA normalization kit(Evrogen),；

• 免疫共沉淀法
  與 RNA 結(jié)合蛋白 Hfq 等免疫共沉淀法由于 Hfq 能夠高效地結(jié)合 sRNA, 并能輔助它們與靶標(biāo) mRNA 結(jié)合, 因此常用于 sRNA 及其靶標(biāo) mRNA 的研究。

  
  
  

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3.3.2 片段化處理

mRNA純化之后的文庫構(gòu)建通常有兩種思路,，一種是先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA,，再進(jìn)行cDNA的片段化，另外一種則是先將mRNA打斷,，再結(jié)合隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

• 先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄mRNA,，再進(jìn)行cDNA的片段化
  此方法先得到長片段的cDNA,，反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA之后再利用DNA片段化的方法進(jìn)行片段化（酶切法或機(jī)械法），得到片段化dsDNA之后的建庫方法與DNA建庫方法完全一致,。
• 先將mRNA打斷,，再結(jié)合隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄
  此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子（Mg2+,、Zn2+）溶液處理法,、酶（RNaseIII）處理法，mRNA片段化之后應(yīng)立即進(jìn)行一鏈cDNA合成,，因?yàn)閙RNA在該體系下非常容易降解,。選擇金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法打斷時(shí)需根據(jù)需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時(shí)間,。（一般設(shè)置為150-200bp 94°C,，15 min； 200-300bp 94°C,，10 min,； 250-550 bp 94°C,，5 min），兩種片段化結(jié)果,，對后期的轉(zhuǎn)錄本有不同的偏好性,，對應(yīng)數(shù)據(jù)可參考下圖：
  
  

  不同方法建庫對后期讀數(shù)的偏好性，紅線代表RNA片段化,，綠線代表反轉(zhuǎn)為cDNA后片段化
  
  先針對mRNA進(jìn)行打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得測序reads主要是針對基因本體的,；若先反轉(zhuǎn)錄，尤其是結(jié)合oligo(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的測reads對轉(zhuǎn)錄本3'端具有比較強(qiáng)的偏好性,，所以在mRNA-Seq中建議采用先對mRNA打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的文庫構(gòu)建方法,。

3.3.3 反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA

在做mRNA測序文庫構(gòu)建的時(shí)候，一般分為常規(guī)建庫和mRNA鏈特異性建庫,。鏈特異性文庫和常規(guī)mRNA文庫最大的區(qū)別在于合成第二鏈cDNA時(shí)加入的核苷酸種類,，如果要構(gòu)建常規(guī)mRNA文庫，則加入dNTP,，而如果要構(gòu)建鏈特異性mRNA文庫則加入dNTP中使用dUTP代替dTTP,，這樣合成的第二鏈cDNA含有U堿基，后期再通過識別U堿基的方法去除第二鏈cDNA,，從而達(dá)到構(gòu)建鏈特異性mRNA的效果,，具體方法包括：使用特殊酶不擴(kuò)增帶有U堿基的鏈；使用UDG酶去除帶有U堿基的合成鏈,。

3.4 小RNA測序

Small RNA是一大類調(diào)控分子,，幾乎存在于所有的生物體中。Small RNA包括：miRNA,、ncRNA,、siRNA、snoRNA,、piRNA,、rasiRNA等等。Small RNA通過多種多樣的作用途徑,，包括mRNA降解,、翻譯抑制、異染色質(zhì)形成以及DNA去除,，來調(diào)控生物體的生長發(fā)育和疾病發(fā)生,。
現(xiàn)行的RNA純化方法如：1）硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉,，因而不適用于Small RNA的分離純化,。2）有機(jī)溶劑抽提能夠較好的保留Small RNA，但是后繼的沉淀步驟比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2）目前還有另外一些Small RNA分離專用的試劑盒,。如MirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纖維濾膜離心柱(glass fiber filter,，GFF)，既能夠富集10 mer以上的RNA分子,，又兼?zhèn)潆x心柱快速離心純化的特點(diǎn),。4）PAGE膠電泳對小RNA進(jìn)行分離可以選擇感興趣的Small RNA長度進(jìn)行研究。Small RNA的長度為18-30nt,。推薦測序長度為35bp,，之后對序列信息進(jìn)行修剪，去除接頭序列僅留下Small RNA序列,。

3.5 環(huán)狀RNA測序

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子,，與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA）不同，circRNA分子合呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu),，且不受RNA外切酶影響,，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解,。
circRNA 測序?qū)otal RNA 的要求與普通的RNA-seq 相同,，所以抽提方法也相同。但是由于 circRNA建庫需要去除 rRNA和線性RNA,，所以需求大量的total RNA,，需提供 ≥22μg的 total RNA，其中20μg 用于 circRNA 建庫,。
全長轉(zhuǎn)錄組也可以獲得circRNA 序列信息,。但是不同之處在于全轉(zhuǎn)錄組測序除了circRNA 序列信息外，還可以獲得mRNA和lncRNA的序列信息,，可以進(jìn)行circRNA-mRNA,、lncRNA-mRNA 關(guān)聯(lián)分析和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，lncRNA的調(diào)控機(jī)制（cis和trans）等分析,；但由于建庫方式的差異和測序數(shù)據(jù)量的限制，全轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的 circRNA類型通常比circRNA測序要少,。而circRNA測序,，只能獲得 circRNA 序列信息，但circRNA測序可以獲得比全轉(zhuǎn)錄組測序更多的circRNA 類型,，可以對circRNA的剪接模式和circRNA類型進(jìn)行更細(xì)致,、深入的分析，便于發(fā)現(xiàn)新的 circRNA,。

4 表觀遺傳學(xué)測序

4.1 甲基化測序

人類大約有30億個(gè)堿基對,，DNA主要發(fā)生在CpG二核苷酸上，基因組中大約有2800萬個(gè)CpG位點(diǎn)。這些CpG位點(diǎn)中,，大約60_{80%被甲基化,，而在一些特定的區(qū)域，比如啟動(dòng)子,，存在CpG位點(diǎn)富集的序列,，我們稱之為CpG島，CpG島通常未被甲基化,。但是在腫瘤細(xì)胞中,，整體甲基化水平降低至20}50%，與正常細(xì)胞相比,，即可能有10_{60%的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)發(fā)生了改變,，也就是大約280}1680萬個(gè)CpG位點(diǎn)。

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,，DMT)的催化下,，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程,。DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位,、鳥嘌呤的N-7位、胞嘧啶的C-5位等,。但在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC),。
DNA甲基化測序方法有上百種，大多數(shù)方法依賴DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化來檢測未甲基化的胞嘧啶,。在文庫制備過程中,，亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化會(huì)將未甲基化/未羥甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在弱酸性條件下,，亞硫酸氫根會(huì)結(jié)合到?jīng)]有甲基化的C堿基的6位,。而甲基化了的C堿基不會(huì)和亞硫酸氫根發(fā)生這個(gè)反應(yīng)。然后用堿來處理,。結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C,，就被脫氨基、脫亞硫酸根,。被轉(zhuǎn)化成U堿基,。用亞硫酸氫鹽來處理DNA，可以讓99%左右的非甲基化的C堿基變成U,。經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的DNA,，再經(jīng)過PCR合成出來的鏈,，U堿基的位置,，就會(huì)被替換成了“T”,。而甲基化的C，因?yàn)闆]有被亞硫酸氫鹽所轉(zhuǎn)化,，所以,，在接下來的測序過程中，被測到的,，還是“C”堿基,。通過測序看一個(gè)位置是“C”還是“T”。如果是“C”,，就說明這個(gè)位置是被甲基化/羥甲基化,。如果是“T”，則說明這個(gè)位置是沒有被甲基化/羥甲基化,。

4.2 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,，ChIP)

通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）檢測和測序技術(shù)相結(jié)合，ChIP測序（ChIP-Seq）成為鑒定轉(zhuǎn)錄因子及其他蛋白因子在全基因組范圍內(nèi)的DNA結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)有力方法,。在ChIP操作之后,，通過特異抗體將DNA結(jié)合蛋白免疫沉淀。結(jié)合的DNA被同時(shí)沉淀,、純化并測序,。