DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)研究的重要范疇，已經(jīng)越來越受到研究者的關(guān)注,。近些年來,，隨著DNA甲基化與組蛋白甲基化的聯(lián)合作用機(jī)制、RNA干擾機(jī)制及去 甲基化機(jī)制的發(fā)現(xiàn),，使得DNA甲基化研究受到廣泛關(guān)注,，從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到動(dòng)植物研究當(dāng)中，同時(shí)在研究方法上也取得了很大的突破?，F(xiàn)在用于DNA甲基化檢測 的方法大概有十多種,，從應(yīng)用上來分，大致可以分成兩類：全基因組甲基化分析及特異位點(diǎn)甲基化檢測,。下面,，我們就這兩大類檢測技術(shù)進(jìn)行分析比較,，以便于在實(shí)際的科研工作中進(jìn)行選擇。

一,、全基因組甲基化檢測技術(shù)

1. 基于芯片平臺(tái)的全基因組甲基化篩選

芯片平臺(tái)作為目前比較成熟的篩選工具,，已經(jīng)在很多領(lǐng)域有了相應(yīng)的應(yīng)用。多家芯片公司在DNA甲基化這塊兒有了相應(yīng)的產(chǎn)品提供,，其中應(yīng)用最為廣泛的就 Agilent平臺(tái)和Illumina平臺(tái),，相應(yīng)的產(chǎn)品包括Agilent Human CpG Island Microarray Kit，Infinium HumanMethylation27 BeadChip和Infinium HumanMethylation450K BeadChip,。另外Roche NimbleGen和Affymetrix也有相應(yīng)的芯片推出,，但是NimbleGen的芯片今年下半年已經(jīng)停產(chǎn)。

不同的芯片平臺(tái),，各自的實(shí)驗(yàn)過程也是不一樣的,。安捷倫前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)。將基因組DNA分成兩份,，一份用來做 MeDIP,，另一份作為對(duì)照。兩個(gè)樣品都標(biāo)記熒光(富集的樣品用Cy5標(biāo)記,，對(duì)照用Cy3標(biāo)記),，然后與芯片雜交,。芯片上每個(gè)探針的Cy5/Cy3強(qiáng)度比 例顯示出該區(qū)域的甲基化程度,。

安捷倫公司芯片平臺(tái)因其強(qiáng)大的eArray探針設(shè)計(jì)平臺(tái)，可以進(jìn)行芯片的定制,。在甲基化領(lǐng)域同樣適用,。

Agilent平臺(tái)因?yàn)镸eDIP技術(shù)本身的特點(diǎn)，都不能到達(dá)單堿基的分辨率,，而Illumina的Infinium和GoldenGate檢測技術(shù)卻做 得到,。Illumina的Infinium甲基化檢測技術(shù)來源與前期的SNP檢測，采用的是單堿基延伸的原理,。分析利用兩個(gè)位點(diǎn)特異的探針檢測這些序列差 異的位點(diǎn),，一個(gè)探針是為甲基化位點(diǎn)(M磁珠類型)設(shè)計(jì)的，而另一個(gè)是為未甲基化位點(diǎn)(U磁珠類型)設(shè)計(jì)的,。探針的單堿基延伸摻入了一個(gè)標(biāo)記的ddNTP,， 它隨后被熒光試劑染色。通過計(jì)算甲基化與未甲基化位點(diǎn)的熒光信號(hào)比例,，可確定檢測位點(diǎn)的甲基化水平,。Illumina公司早期推出的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆蓋27,578個(gè)CpG位點(diǎn)。這款芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用,，除了和腫瘤相關(guān)的甲基化篩選之外,，也能用于其他疾病相關(guān)甲基化檢 測,。因此對(duì)這款產(chǎn)品，研究者給予了很高的評(píng)價(jià),，目前此產(chǎn)品已停產(chǎn),，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過45萬個(gè)甲基化位點(diǎn),，實(shí)現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的全面覆蓋,。此外，還包括CpG島之外的CpG 位點(diǎn),，在人類干細(xì)胞中鑒定出的非CpG甲基化位點(diǎn),，以及腫瘤和正常組織中差異表達(dá)的甲基化位點(diǎn)等等。它的高覆蓋度,、高通量以及低價(jià)格,，讓它成為進(jìn)行全基因 甲基化篩選的有力武器。

相比之下,，VeraCode GoldenGate甲基化分析技術(shù)更適合中通量的篩選及驗(yàn)證研究,，它以以矩陣微珠芯片(Sentrix Array Matrix(SAM)）形式分析48至384個(gè)用戶指定的CpG位點(diǎn)。首先,，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA 與分析oligo混合,，oligo與未甲基化位點(diǎn)的U互補(bǔ)，或者與甲基化位點(diǎn)的C互補(bǔ),。雜交之后,，引物延伸，并連接上位點(diǎn)特異的oligo來產(chǎn)生通用 PCR的模板,。最后,，用標(biāo)記的PCR引物生成可檢測的產(chǎn)物。據(jù)Illumina的產(chǎn)品專家介紹,，其產(chǎn)品的最大優(yōu)勢在于單個(gè)CpG位點(diǎn)的分辨率,。其它分析將 甲基化定位在一段區(qū)域，而通過Illumina分析,，你能精確測定某個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平,。

2. 基于高通量測序平臺(tái)的甲基化圖譜分析

隨著二代測序技術(shù)的告訴發(fā)展，測序成本大幅度下降,，使得真正實(shí)現(xiàn)全基因組甲基化分析的研究成為可能,。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經(jīng)陸續(xù)有多個(gè)物種的甲 基化圖譜構(gòu)建完成,。研究者將傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測方法,，如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測序相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)單堿基精度的甲基化圖譜的構(gòu)建。此外將成熟的 MeDIP技術(shù)與二代測序相結(jié)合,，可以快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域,，從而比較不同細(xì)胞、組織,、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異,。因此 該技術(shù)也特別適用于大樣本量的疾病表觀研究。

第三代測序技術(shù)的出現(xiàn),，更是讓甲基化的直接測定成為可能,。一年前，美國Pacific Biosciences公司利用獨(dú)有的單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測序技術(shù),，直接測定了DNA的甲基化,。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。

二,、特異位點(diǎn)甲基化檢測技術(shù)應(yīng)用比較

1.甲基化特異性PCR（MS-PCR）

DNA在亞硫酸氫鹽作用后,，DNA CpG若無甲基化，則序列中的C改變?yōu)閁,，若有甲基化則保持不變,，因此從理論上講，用不同的引物做PCR,，即可檢測出這種差異,，從而確定基因有無CpG島 甲基化。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變,，就可以相應(yīng)設(shè)計(jì)M和U引物,，有時(shí)我們需要設(shè)計(jì)兩輪引物。

這種方法靈敏度高,，無需特殊儀器,，因此經(jīng)濟(jì)實(shí)用，是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測方法,。不過也存在一定的局限性，預(yù)先需要知道待測片段的DNA序列,，引物的設(shè)計(jì)非常重要,。另外，亞硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵,，若處理不完全則可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn),。

2. 亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)

這種方法一度被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后,，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段,，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，將 序列與未經(jīng)處理的序列進(jìn)行比較,，判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化,。這種方法可靠,，且精確度高，能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),，但因?yàn)樯婕暗?測序,，其結(jié)果準(zhǔn)確但要求克隆時(shí)所挑克隆較多，操作繁瑣,，不易大批量操作,。另外，甲基化程度的定量依賴于挑選克隆的數(shù)目,，因此這種方法只能算得上是一種半定 量的技術(shù)方法,。

目前一般會(huì)先用BSP找到甲基化位點(diǎn)，然后根據(jù)甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)MSP引物,，進(jìn)行相應(yīng)PCR條件摸索,，以用于大量樣本的篩選。

3.甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)

通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異,，因此DNA樣本經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后,，甲基化與未甲基化DNA會(huì)存在序列差異，這種差異可 通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn),。使用該方法進(jìn)行甲基化分析僅需一對(duì)引物,，相對(duì)簡單，不過這種方法對(duì)儀器的要求頗高,，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀,，并且在 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR過程中，需要使用飽和的熒光染料,。利用MS-HRM技術(shù)進(jìn)行甲基化檢測只能對(duì)檢測片段整體甲基化情況進(jìn)行分析,，并不能明確每個(gè)CpG位 點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測,，篩選出感興趣的CPG位點(diǎn),，然后利用其他方法進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)的精確檢測及甲基化程度的精確定量。

4. 聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法（COBRA）

這種方法是將亞硫酸氫鹽處理與酶切相結(jié)合來進(jìn)行甲基化檢測,。DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,，利用PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶（BstUI） 消化,。若其識(shí)別序列中的C發(fā)生完全甲基化(5mCG5mCG),，則 PCR擴(kuò)增后保留為CGCG，BstU I能夠識(shí)別并進(jìn)行切割,；若待測序列中,，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)門GTG，BstUI識(shí)別位點(diǎn)丟失,，不能進(jìn)行切割,。這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳分離、探 針雜交,、掃描定量后即可計(jì)算出原樣本中甲基化的比例,。

這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是相對(duì)簡單，可進(jìn)行快速定量,，且需要的樣本量少,。然而，它的局限性也十分明顯,，只能獲得特殊酶切位點(diǎn)的甲基化情況,，且陰性結(jié)果并不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能。

5. 熒光定量法（Methylight）

這種技術(shù)是在MSP技術(shù)上發(fā)展起來的,，在MSP擴(kuò)增過程中利用熒光染料進(jìn)行定量,。TaqMan? 探針法的應(yīng)用使得該技術(shù)具有更高的精確性。其原理與SNP檢測類似,，針對(duì)亞硫酸氫鹽處理之后的DNA片段,，在甲基化位點(diǎn)上會(huì)存在單堿基的差異，根據(jù)這種差 異進(jìn)行探針設(shè)計(jì),，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,，就能夠檢測甲基化的差異。這種方法最大的優(yōu)勢在于其高敏感性和較高通量,，且無需在PCR后電泳,、雜交等操作，減 少了污染和操作誤差,。但是TaqMan? 探針訂購費(fèi)用較高,，適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本篩選。

6. 焦磷酸測序(Pyrosequencing)

隨著技術(shù)的不斷改進(jìn),，現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測新的金標(biāo)準(zhǔn),。焦磷酸測序作為一種新的序列分析技術(shù)，能夠快速地 檢測甲基化的頻率,，對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性及定量檢測,，為甲基化研究提供了新的途徑。在序列延伸過程中,，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個(gè)位點(diǎn)的 C-T 比例。因此,，不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測,，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。

QIAGEN公司在焦磷酸測序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢，目前提供三種焦磷酸測序儀器,，通量由低到高,，適合不同的應(yīng)用。PyroMark Q24 的強(qiáng)項(xiàng)在于可對(duì)多達(dá)24個(gè)樣品進(jìn)行焦磷酸測序,。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMark Q96 ID 上進(jìn)行,。在考慮到處理成百上千個(gè)樣品所需的大量試劑時(shí)，運(yùn)行通量最大化可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)成本變得很高,。而PyroMark Q96 MD裝有一臺(tái)高度靈敏的光檢測攝像頭,，可以在減少試劑量的情況下對(duì)少量的DNA模板進(jìn)行準(zhǔn)確測序。這些不同平臺(tái)的推出,，對(duì)于我們實(shí)際研究提供了更有效的檢測手段,。

雖然焦磷酸測序可以進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)甲基化程度的精確定量，但是目前來看,，測序的片段長度還比較短,，只有一百多bp，其中有效長度約為60bp,。

以上是對(duì)幾種常用的特異位點(diǎn)甲基化檢測方法進(jìn)行了介紹及比較,，還有一些檢測技術(shù)是在常用的檢測手段上進(jìn)行優(yōu)化或者將不同的方法進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用，比如以MSP 方法為基礎(chǔ),，發(fā)展了SMART-MSP技術(shù),，該技術(shù)利用定量技術(shù)對(duì)MSP擴(kuò)增過程進(jìn)行檢測，同時(shí)后續(xù)結(jié)合HRM技術(shù)來分析甲基化差異,。此外,，利用質(zhì)譜平臺(tái) 進(jìn)行甲基化檢測的有MALDI-TOF技術(shù)，可以對(duì)甲基化進(jìn)行精確檢測并能進(jìn)行高通量篩選,。從對(duì)這些技術(shù)的比較分析來看,，沒中檢測技術(shù)都有各自的優(yōu)點(diǎn)，并也存在一定的局限性,，研究者可以根據(jù)自己的實(shí)際研究情況進(jìn)行選擇,。