DNA甲基化與遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性

在生物個體的生長發(fā)育與繁殖過程中，維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的,。細(xì)胞采用多種機制來保證DNA復(fù)制的忠實性,，如DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)與半保留復(fù)制模式為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；DNA聚合酶Ⅲ除了具有DNA聚合酶活性外還具有5’到3’的核酸外切酶活性,，可及時去除錯配摻人的堿基,；DNA復(fù)制后存在多種修復(fù)機制進一步保證了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。DNA甲基化在DNA復(fù)制起始,、錯配修復(fù),、細(xì)菌中寄主控制的修飾與限制以及轉(zhuǎn)座子的失活等過程中對維持遺傳信息的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用,。

DNA甲基化與基因表達調(diào)控

在真核生物基因組中，基因僅僅占一小部分,，例如在人類基因組中基因的編碼序列還不到2％,，那么在大量非編碼DNA存在的情況下，實現(xiàn)精確控制基因的表達,，降低周圍的轉(zhuǎn)錄噪音對生物體至關(guān)重要,。DNA甲基化作為一種可遺傳的修飾方式為非編碼DNA(內(nèi)含子、重復(fù)元件以及潛在的具有活性的轉(zhuǎn)座子)的長期沉默提供了一種有效的抑制機制010],。DNA復(fù)制后胞嘧啶的甲基化會改變DNA的構(gòu)象,，使DNA的大溝無法與DNA結(jié)合蛋白正常結(jié)合，從而使這些非編碼區(qū)長期保持無表達活性的狀態(tài),。而有轉(zhuǎn)錄活性的基因可利用非甲基化的啟動子來進行轉(zhuǎn)錄表達,，即使在相鄰的非轉(zhuǎn)錄區(qū)是高度甲基化的，其啟動子仍然可以起始轉(zhuǎn)錄并被調(diào)控,。

DNA甲基化與表觀遺傳學(xué)

過去人們一直以為遺傳和環(huán)境兩大因素共同決定生物體的性狀,，然而人們無法合理解釋馬和驢的正反交后代、同卵雙胞胎差別以及x染色體失活等現(xiàn)象,。1942年Waddington首次提出了表觀遺傳學(xué)(epigenetics)的概念,，它針對研究基因型與表型的關(guān)系，使經(jīng)典的孟德爾核內(nèi)遺傳規(guī)律無法解釋的現(xiàn)象得到了合理而完美的解釋,?；蚪M表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化修飾與核小體中組蛋白的修飾等，使得被修飾DNA的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,，導(dǎo)致基因的沉默或過度表達,。這兩種修飾都是在不改變DNA堿基種類與數(shù)量的前提下使生物體表型呈現(xiàn)出多樣化。DNA甲基化對基因表達模式以及基因組穩(wěn)定性均起著至關(guān)重要的作用,，并在印跡基因與x染色體失活等典型的表觀遺傳現(xiàn)象中起重要作用,。

DNA甲基化與胚胎發(fā)育

DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾，在體細(xì)胞增殖過程中通過依賴于DNA復(fù)制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmtl穩(wěn)定地傳遞給子細(xì)胞,。但在胚胎發(fā)育的不同時期,，基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會發(fā)生劇烈的改變，改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段,，甲基化模式在配子形成時已經(jīng)建立舊1,。DNA甲基化對胚胎正常發(fā)育和等位基因的選擇表達至關(guān)重要。錯誤甲基化模式的建立將引起人類的疾病,，如Prader-Willi綜合征,、Angelman綜合征和脆性x染色體綜合征等。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一,，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶,。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達,。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控,。脊椎動物DNA的甲基化狀態(tài)與生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)，比如在腫瘤發(fā)生時,，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加,，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達的下降,。

甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR,，MSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變,；隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物,，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段,，則說明該位點存在甲基化；反之,，說明被檢測的位點不存在甲基化,。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進行PCR,，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,，最后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序,，可以提高測序成功率,，這種方法稱為BSP-克隆測序法,。

高分辨率熔解曲線法（High Resolution Melting,，HRM）

在非CpG島位置設(shè)計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島,。若這些CpG島發(fā)生了甲基化,，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變,，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化

DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化下,，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程,。哺乳動物基因組中，DNA甲基化多發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子,。DNA甲基化是一種表觀（epigenetic）修飾,，它在不改變DNA序列的情況下，對個體的生長,、發(fā)育,、基因表達模式以及基因組的穩(wěn)定性起到重要的調(diào)控作用，并且這種修飾在發(fā)育和細(xì)胞增殖的過程中是可以穩(wěn)定傳遞的,。近年來的大量研究表明,，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,、細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系,。

DNA甲基化作為腫瘤生物標(biāo)志物

DNA甲基化在腫瘤中的作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：一是甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶，造成基因突變,；二是抑癌基因和DNA修復(fù)基因由于超甲基化而沉默,；三是癌基因甲基化水平降低而活化；四是基因組總體甲基化水平降低使轉(zhuǎn)座子,、重復(fù)序列活化導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降,。這些因素是導(dǎo)致腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移,、惡化最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因,。DNA總體甲基化水平（即甲基化譜）和特定基因甲基化程度改變可作為腫瘤診斷指標(biāo)。

甲基化與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移

DNA甲基化在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用,，如有研究發(fā)現(xiàn)了數(shù)個可以誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子,，在正常細(xì)胞中它們表現(xiàn)為高甲基化水平因而其表達受到抑制，但在腫瘤細(xì)胞中它們的甲基化水平偏低而出現(xiàn)高表達,。利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）抑制劑5-氮雜胞苷（5-aza-cytidine）處理MCF-7乳腺癌細(xì)胞,，使其維持低甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示與EMT過程相關(guān)的促細(xì)胞侵襲基因（pro-invasive EMT-associated gene）表達上調(diào),，細(xì)胞的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力增強,。此類研究結(jié)果值得我們深思，采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑來治療腫瘤固然可能抑制原癌基因的表達,，但也可能造成腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移播散增加的風(fēng)險,。

甲基化與腫瘤治療

腫瘤預(yù)防和治療的一個手段是通過去甲基化恢復(fù)某些關(guān)鍵的抑癌基因或DNA修復(fù)基因的活性，目前研究最多的是DNMTs抑制劑,，它通過抑制DNMT活性以逆轉(zhuǎn)異常的DNA甲基化,。第一個表型修飾藥物為5-azacytidine及其類似物5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-CdR），這類藥物已經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于白血病前骨髓增生異常綜合征的治療,。5-aza-CdR是胞嘧啶的類似物,，在DNA復(fù)制過程中可以摻入到DNA鏈中,，一方面它可以降低DNA接收甲基的能力，另一方面它抑制DNMT活性,，導(dǎo)致DNA甲基化水平的降低,。體外和體內(nèi)試驗均表明，5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑癌基因甲基化水平從而抑制腫瘤的能力,，臨床表明應(yīng)用5-aza-CdR可提高部分IV期小細(xì)胞肺癌患者生存率,，但該藥也存在著不可忽視的毒副作用（如特異性不強，不能針對某一特定抑癌基因進行靶向治療,；高劑量的5-aza-CdR可能誘發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移）,，因此其在臨床上的應(yīng)用受到了很大限制。也有研究表明,，低劑量的As2O3可起到治療肝癌的目的,。

突破性測序技術(shù)繪制甲基化圖譜

美國科學(xué)家通過一種稱作單分子實時（SMRT）DNA測序的新技術(shù)，研究人員首次繪制了致病菌全基因組甲基化標(biāo)記圖譜,。通過比較相關(guān)菌株之間的甲基化模式,，他們發(fā)現(xiàn)了稱作噬菌體的病毒感染細(xì)菌顯著改變宿主的一種方式。進一步研究對改變大腸桿菌特性至關(guān)重要的甲基基團將有助于研究人員了解甲基化對細(xì)菌生命周期,、傳染力,、甚至或許是耐藥性的作用。[詳細(xì)]

信使RNA中存在高水平的甲基化現(xiàn)象

康奈爾大學(xué)的研究者發(fā)現(xiàn),，信使RNA—DNA的鏡像拷貝,，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成—也會發(fā)生甲基化。對大鼠的各種組織進行分別的分析之后發(fā)現(xiàn),，甲基化的RNA集中在大腦,、肝及腎臟中。并且,，來自大鼠胚胎的樣本分析表明,，當(dāng)胚胎大腦進入到生長的后期時，這種RNA的濃度上升了70倍,，從而說明這些甲基化RNA很可能在發(fā)育中發(fā)揮基本作用,。基化的腺嘌呤容易成簇出現(xiàn)在RNA鏈上蛋白質(zhì)合成完成的位點,，其他的蛋白質(zhì)結(jié)合到這個區(qū)域改變或終止蛋白質(zhì)的生產(chǎn),。這就表明,，這種甲基化可能發(fā)揮著指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成時機及合成量的作用,。[詳細(xì)]

機體存在DNA主動去甲基化調(diào)控機制

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)研究所的研究人員以間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化為實驗?zāi)Ｐ?中證實機體存在DNA主動去甲基化調(diào)控機制，生長阻滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白Gadd45a在該過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,。研究發(fā)現(xiàn),，Gadd45a介導(dǎo)的成骨基因表達的去甲基化調(diào)控主要發(fā)生于啟動子的CpG島外（island shore）中等密度區(qū),，而非通常認(rèn)為的高密度CpG島，而且Gadd45a介導(dǎo)的主動去甲基化主要發(fā)生在若干特定的CpG位點上,。從而提出在DNA主動去甲基化過程中可能存在一種位點特異性去甲基化機制,。[詳細(xì)]

DNA去甲基化機制研究發(fā)現(xiàn)一種新的修飾堿基

中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的工作證明，DNA中的5mC和5hmC都可以被Tet家族的雙加氧酶進一步氧化為第7種堿基：5-羧基胞嘧啶（5caC）,；此外,，胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）可以特異性地識別這一新的堿基修飾形式，并將其從基因組中切除,。[詳細(xì)]