|
編譯：思越，編輯：夏甘草,、江舜堯,。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載,。 導(dǎo)讀
m6A甲基化修飾與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),，但是在骨肉瘤中的潛在作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究通過RNA測序和甲基化測序,，證實(shí)了癌基因WTAP通過m6A修飾抑制靶基因HMBOX1表達(dá),，減弱了對骨肉瘤生長與轉(zhuǎn)移的抑制作用,，并在體內(nèi)與體外進(jìn)行了驗證，以闡明m6A修飾在骨肉瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵作用,，為骨肉瘤的治療提供新的見解,。
原名：WTAP promotes osteosarcoma tumorigenesis by repressing HMBOX1 expression in an m6A-dependent manner 譯名：WTAP通過m6A依賴性抑制HMBOX1表達(dá)促進(jìn)成骨肉瘤的形成 期刊：Cell Death & Disease IF：6.304 發(fā)表日期：2020年8月19日 通訊作者：苗驚雷 通訊作者單位：中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 DOI號：10.1038/s41419-020-02847-6 作者首先通過公共數(shù)據(jù)庫檢測m6A相關(guān)基因的表達(dá)差異，并選擇writer WTAP進(jìn)行后續(xù)分析,。接下來利用shRNA慢病毒敲除WTAP基因,，使用CCK8和集落形成實(shí)驗探究骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力變化，通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗和劃痕實(shí)驗證明侵襲和遷移能力變化,。通過轉(zhuǎn)錄組測序來闡明WTAP敲除細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變,，MeRIP-seq鑒定m6A修飾基因，并整合公共CLIP-seq數(shù)據(jù),，建立了RNA-seq,，MeRIP-seq和CLIP-seq的基因重疊，通過RT-qpcr鑒定出HMBOX1是上調(diào)最明顯的基因,。通過m6A斑點(diǎn)印跡法和RNA甲基化定量法檢測WTAP敲除后的m6A整體水平,。接著作者構(gòu)建敲除m6A結(jié)合位點(diǎn)的HMBOX1突變體進(jìn)行了熒光素酶報告基因鑒定。最后在體內(nèi)和體外實(shí)驗證明了HMBOX1參與WTAP介導(dǎo)的骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移,。1.WTAP升高與骨肉瘤患者不良預(yù)后相關(guān)為了探究m6A在骨肉瘤中的作用,，作者通過公共數(shù)據(jù)(GSE87624)檢測了17個m6A相關(guān)基因在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)WTAP,、RBM15,、YTHDF1和YTHDF2在腫瘤組織中的表達(dá)與對照存在差異（圖1a）。由于m6A writer在癌癥進(jìn)展中起到重要作用,，于是選擇WTAP進(jìn)行下一步分析,。接著，作者檢測了104個癌癥樣本與癌旁樣本（TXHCSU）WTAP的表達(dá),，結(jié)果顯示W(wǎng)TAP在腫瘤組織的表達(dá)增高（圖1b）,，蛋白水平也明顯上調(diào)（圖1c），Kaplan-Meier分析顯示,，WTAP表達(dá)水平越高的患者生存率越低（圖1d）,。通過單因素和多因素cox分析，發(fā)現(xiàn)WTAP的過表達(dá)是OS患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素（圖1e）,，使用諾模圖預(yù)測患者的總生存率,，校正曲線顯示，患者的實(shí)際存活率和諾模圖預(yù)測結(jié)果具有較好的一致性（圖1f）,。此外,，在骨肉瘤細(xì)胞中WTAP也是高表達(dá)的。綜上所述,，WTAP在骨肉瘤中高表達(dá),，并與其不良預(yù)后相關(guān),。
圖1 WTAP在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平2.體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)沉默WTAP可抑制骨肉瘤進(jìn)展作者接下來利用shRNA慢病毒(shWTAP#1和shWTAP#2)建立了WTAP基因敲除的骨肉瘤細(xì)胞，使WTAP表達(dá)下調(diào)（圖2a）,，并分析WTAP在骨肉瘤細(xì)胞遷移,、侵襲和增殖中的作用。CCK8和集落形成實(shí)驗表明,，WTAP的缺乏抑制了兩種細(xì)胞系（HOS,，U2OS）的增殖能力（圖2b，c）,，并通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗和劃痕實(shí)驗證明沉默WTAP顯著降低骨肉瘤的侵襲和遷移能力（圖2d，e）,。綜上所述,，WTAP在骨肉瘤中促進(jìn)了細(xì)胞增殖,、遷移和侵襲,。
3.HMBOX1被認(rèn)為是骨肉瘤中WTAP的潛在靶點(diǎn)為了了解WTAP調(diào)控骨肉瘤進(jìn)展的潛在機(jī)制，作者通過轉(zhuǎn)錄組測序來闡明WTAP敲除細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變,。WTAP失活后,，層次聚類顯示共有521個差異基因下調(diào)，624個差異基因上調(diào),。GO分析顯示差異基因富集于中性粒細(xì)胞活化,、細(xì)胞周期等過程，KEGG分析表明差異基因附近與代謝相關(guān)信號通路,。通過MeRIP-seq鑒定出546個m6A修飾基因,。為了縮小下游靶點(diǎn)的范圍，作者整合了GEO的CLIP-seq數(shù)據(jù)（GSE46705）,，建立了RNA-seq,，MeRIP-seq和CLIP-seq的基因重疊（圖3a）。韋恩圖共鑒定出6個基因,，包括2個上調(diào)基因（SLC3A2,，CASP7），4個下調(diào)基因（ABR,，HS6ST1,，CD59和HMBOX1），并在GEO數(shù)據(jù)（GSE87624）以及TXHCSU腫瘤組織中驗證這些基因的表達(dá)趨勢,。接著,，作者使用RT-qPCR來評估WTAP對每個候選基因的影響。其中,，在WTAP沉默后,，HMBOX1的上調(diào)最為明顯（圖3b），并通過分析證實(shí)了HMBOX1蛋白水平的升高（圖3c）,。接著,，作者分析了WTAP和HMBOX1在GEO數(shù)據(jù)（GSE87624）和TXHCSU中表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HMBOX1的表達(dá)與WTAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),，且在TXHCSU中HMBOX1的表達(dá)隨著腫瘤體積和轉(zhuǎn)移而降低,，生存分析表明，HMBOX1水平低的患者具有更低的總體生存率（圖3e）,。通過單變量和多變量分析表明,，HMBOX1是骨肉瘤患者總存活率的獨(dú)立預(yù)后因素（圖3f）。此外,，HMBOX1在骨肉瘤細(xì)胞系（SJSA-1,，MG-63，HOS,，U2OS和143B）中的表達(dá)低于在人成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）中的表達(dá)(圖3g),。綜上所述，HMBOX1是WTAP的一個潛在靶點(diǎn),，并與骨肉瘤患者的不良預(yù)后有關(guān),。
圖3 HMBOX1是WTAP的潛在靶點(diǎn)4.WTAP通過m6A修飾調(diào)節(jié)骨肉瘤HMBOX1的表達(dá)為了確定HMBOX1的m6A修飾是否通過WTAP介導(dǎo)，作者使用m6A斑點(diǎn)印跡法和RNA甲基化定量法,，來檢測陰性對照組和穩(wěn)定的WTAP敲低組的m6A的整體水平,。結(jié)果表明，隨著WTAP的缺失,，兩株骨肉瘤細(xì)胞系m6A水平顯著降低（圖4a）,。此外，通過MeRIP-qPCR檢測m6A在HMBOX1的富集情況,。發(fā)現(xiàn)未敲除WTAP的細(xì)胞中,，m6A特異性抗體較強(qiáng)地富集了HMBOX1轉(zhuǎn)錄本（圖4b），并通過在線網(wǎng)站SRAMP (http://www./sramp)預(yù)測出HMBOX1的3'UTR處存在3個高置信度的m6A位點(diǎn),。作者用野生型（WT）和3個突變體（Mut）進(jìn)行了熒光素酶報告基因鑒定,，對于Mut報告基因，預(yù)測m6A位點(diǎn)的幾個腺苷堿基（A）被胞嘧啶堿基（C）取代,，以消除m6A甲基化的影響,，而WT報告基因包含完整的m6A位點(diǎn)（圖4c）。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，WT組的熒光素酶活性在WTAP敲低作用下顯著增強(qiáng),，而Mut組的熒光素酶活性對WTAP沉默的影響具有一定的抵抗作用（圖4d），說明HMBOX1的調(diào)控受到WTAP誘導(dǎo)的m6A修飾的控制,。此外,，作者還研究了reader YTHDF2在骨肉瘤的表達(dá)和HMBOX1表達(dá)的作用,。在GEO數(shù)據(jù)（GSE87624）、骨肉瘤組織和細(xì)胞中觀察到Y(jié)THDF2的顯著上調(diào)（圖4e）,，但未發(fā)現(xiàn)WTAP沉默對HMBOX1的表達(dá)沒有影響（圖4f）,，說明WTAP通過不依賴YTHDF2的方式介導(dǎo)m6A以調(diào)節(jié)HMBOX1的表達(dá)。
圖4 HMBOX1與WTAP表達(dá)呈負(fù)相關(guān),，并與骨肉瘤不良預(yù)后有關(guān)5.HMBOX1參與WTAP介導(dǎo)的骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移接著作者探究了HMBOX1是否參與WTAP介導(dǎo)的骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移,。通過敲低WTAP后，HMBOX1表達(dá)明顯增加,；而敲低HMBOX1顯著降低了WTAP依賴性（圖5a）,。CCK8結(jié)果表明，WTAP沉默的細(xì)胞中敲低HMBOX1增加了細(xì)胞的增殖水平（圖5b）,，在克隆形成實(shí)驗中沉默HMBOX1也減輕了shWTAP介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制（圖5c）,，并在細(xì)胞侵襲實(shí)驗和劃痕實(shí)驗中觀察到同樣的效果（圖5d，e）,。此外，沉默WTAP后,，敲低HMBOX1抑制了骨肉瘤細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)志物(鈣粘蛋白和波形蛋白)的表達(dá),，并誘導(dǎo)了上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖5f）。上述結(jié)果表明,，WTAP 通過抑制 HMBOX1的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,。接著，作者通過誘導(dǎo)小鼠皮下骨肉瘤模型,、原位異種移植瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型,，驗證HMBOX1在體內(nèi)的作用。沉默WTAP顯著上調(diào)皮下骨肉瘤組織中HMBOX1的表達(dá)水平（圖6a）,，顯著降低腫瘤提及和重量,，并通過降低HMBOX1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)表型逆轉(zhuǎn)（圖6b）。接著作者借助GFP標(biāo)記構(gòu)建了原位異種移植瘤模型,。生物發(fā)光成像顯示,，WTAP基因敲除降低了U2OS細(xì)胞的原位增殖，而沉默HMBOX1減輕了對細(xì)胞增殖的抑制作用(圖6C),。為了進(jìn)一步檢測WTAP和 HMBOX1對骨肉瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，生物法光成像顯示沉默HMBOX1減輕了沉默WTAP后對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用(圖6d),。綜上所述,，HMBOX1參與WTAP介導(dǎo)的骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移。
圖5 HMBOX1作為腫瘤抑制因子參與WTAP介導(dǎo)的骨肉瘤進(jìn)展
圖6 在體內(nèi)沉默HMBOX1可減弱shWTAP對骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制6.WTAP/HMBOX1通過PI3K/AKT途徑調(diào)控骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移KEGG結(jié)果表明,，PI3K / AKT途徑可以受WTAP調(diào)控,，而PI3K / AKT信號通路可促進(jìn)骨肉瘤等多種癌癥的生長,，遷移和侵襲。通過沉默WTAP,，磷酸化PI3K/AKT被顯著抑制,，而沉默HMBOX1后顯著減弱了這種抑制作用（圖7a），此外,，使用LY294002對PI3K/AKT進(jìn)行抑制后,，顯著降低shHMBOX1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（圖7b,，c）,。總之,，WTAP/HMBOX1可通過PI3K/AKT途徑調(diào)控骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移(圖8),。
圖7 WTAP/HMBOX1通過PI3K/AKT通路參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展
作者通過公共數(shù)據(jù)庫檢測m6A相關(guān)基因的表達(dá)差異,，并選擇writer WTAP進(jìn)行后續(xù)分析,，并發(fā)現(xiàn)WTAP可以調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移,。并通過轉(zhuǎn)錄組測序和MeRIP-seq找出m6A修飾基因HMBOX1。在確定WTAP的沉默與表達(dá)影響m6A的整體水平后,，通過構(gòu)建HMBOX1的m6A結(jié)合位點(diǎn)突變體證明WTAP調(diào)控HMBOX1的表達(dá)，并通過體內(nèi)和體外實(shí)驗證明HMBOX1表達(dá)可以受到WTAP的調(diào)控,，且HMBOX1參與了骨肉瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移過程,。整篇思路是十分清晰的,，此外作者通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)PI3K / AKT途徑可以受WTAP調(diào)控，WTAP/HMBOX1通過PI3K/AKT途徑調(diào)控骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移,，但是對于HMBOX1如何調(diào)控PI3K/AKT通路作者沒有繼續(xù)深入研究,。總之，本文發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中WTAP升高與不良的臨床結(jié)果相關(guān),，并可作為骨肉瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素,。WTAP通過以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)HMBOX1的表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,，并部分通過PI3K/AKT途徑,，提示W(wǎng)TAP/HMBOX1可能是一個潛在的骨肉瘤治療靶點(diǎn)。
更多推薦 1 高分綜述 | Trends in Biotechnology: 單細(xì)胞分辨率下利用空間轉(zhuǎn)錄組揭示器官分子結(jié)構(gòu)（國人佳作）
|
