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基本信息 Title: Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m6A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal March 15, 2018 Journal: Molecular Cell IF: 14.714
m6A作為真核生物mRNA廣泛存在的表觀調(diào)控形式,，通過不同的機(jī)制（如影響mRNA穩(wěn)定性,、剪切,、轉(zhuǎn)運(yùn)及翻譯等）針對mRNA進(jìn)行調(diào)控。目前在m6A相關(guān)的Writer,、eraser,、reader不同階段參與的各種蛋白及機(jī)制不斷涌現(xiàn)，不過仍然還有眾多未知的參與蛋白及其機(jī)制等待發(fā)現(xiàn)挖掘,。本研究就發(fā)現(xiàn)并證明了一種全新蛋白ZC3H13,，在細(xì)胞核內(nèi)m6A的生成作用顯著。通過敲出小鼠胚胎干細(xì)胞中ZC3H13基因,，可以明顯降低mRNA整體的m6A水平,，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中大部分的WTAP、Virlizer,、Hakai轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,，說明ZC3H13在細(xì)胞核內(nèi)可以定位形成ZC3H13-WTAP-Virlizer-Hakai復(fù)合物，從而對于m6A進(jìn)行調(diào)控,。此外,，ZC3H13的敲除，可以影響干細(xì)胞的自我修復(fù)功能,，進(jìn)而影響干細(xì)胞的分化,。 基于主題是關(guān)于m6A科研方案的介紹，所以博淼生物本次主要圍繞該文獻(xiàn)中ZC3H13對于m6A生成的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行闡述,。其余功能機(jī)制在此不再敖述,。 結(jié)果討論 一、ZC3H13與WTAP,、Virlizer、Hakai相互作用機(jī)制 通過免疫共沉淀技術(shù),，研究ZC3H13蛋白的功能,，證明了與WTAP、Virlizer,、Hakai的相互作用,，形成穩(wěn)定的大分子復(fù)合物。并根據(jù)該蛋白的四個結(jié)構(gòu)區(qū)域,，是該蛋白的C端區(qū)域與其他三個蛋白結(jié)合,。 二、抑制ZC3H13的表達(dá)可以降低RNA的整體m6A水平 通過shRNA干擾技術(shù)針對小鼠干細(xì)胞中的ZC3H13進(jìn)行表達(dá)抑制,，采用LC-MS/MS技術(shù)檢測整體m6A水平值,，在兩個不同的抑制ZC3H13表達(dá)細(xì)胞系中，其整體m6A水平值減少到0.13%和0.15%,，相當(dāng)于與對照細(xì)胞相比,，降低了30%—40%,。為了避免shRNA技術(shù)可能的脫靶效應(yīng)，重新在干擾的細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入ZC3H13基因,，發(fā)現(xiàn)整體mRNA的m6A水平重新回歸到0.33%,，相當(dāng)于對照細(xì)胞的85%。上述數(shù)據(jù)充分說明該基因?qū)τ趍RNA中m6A的生成作用,。 三,、在ZC3H13基因缺失導(dǎo)致的m6A降低區(qū)域主要發(fā)生在mRNA的3UTR區(qū)域 采用 MeRIP-seq技術(shù)，對于干擾ZC3H13基因的小鼠干細(xì)胞及對照細(xì)胞進(jìn)行m6A測序,，在攜帶對照shRNA的野生態(tài)細(xì)胞中共計(jì)分析獲取12368個m6A peaks,，采用MEME分析發(fā)現(xiàn)富集區(qū)域motif序列為GGACU，屬于經(jīng)典的m6A保守序列,。干擾ZC3H13基因表達(dá)的細(xì)胞中,，發(fā)現(xiàn)減少了836個m6A peak，新增了318個m6A peak,，并且通過MeRIP-qPCR技術(shù)證實(shí)許多m6A peak水平顯示不同程度的降低,，為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過兩個樣本的生物學(xué)重復(fù),，數(shù)據(jù)重復(fù)性良好,。此外發(fā)現(xiàn)，m6A水平降低的區(qū)域主要發(fā)生在mRNA的3UTR區(qū)域,，而不是5UTR區(qū)域,。上述發(fā)現(xiàn)說明ZC3H13是小鼠干細(xì)胞中大量m6A甲基化發(fā)生的重要因素。為了進(jìn)一步證明上述結(jié)論,，通過攜帶位于3UTR區(qū)域的m6A位點(diǎn)突變及野生型的B-球蛋白報(bào)告基因,，分別轉(zhuǎn)染到ZC3H13干擾及對照的小鼠干細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ZC3H13導(dǎo)致m6A的生成全完依靠該報(bào)告基因中對應(yīng)區(qū)域的A位點(diǎn)存在,。 之前MeRIP-seq研究發(fā)現(xiàn)了小鼠干細(xì)胞大量的Mettl3參與生成的m6A peaks,通過與本研究中發(fā)現(xiàn)的ZC3H13參與生成的m6A peaks進(jìn)行比較,，有大量的重復(fù)出現(xiàn)。通過Heatmap分析顯示,，在小鼠干細(xì)胞中干擾兩個基因之后m6A peaks降低的模式相似,。這些數(shù)據(jù)說明ZC3H13很有可能通過已知的Mettl3了聯(lián)合發(fā)生m6A調(diào)控作用。 四,、干擾ZC3H13可以改變WTAP,、Virlizer、Hakai的細(xì)胞定位 之前的研究表明m6A的發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi),，已經(jīng)明確重要功能機(jī)制的甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶等均定位在細(xì)胞核內(nèi),。同樣，ZC3H13復(fù)合物與影響pre-mRNA剪切因子SC35共同定位與細(xì)胞核內(nèi),，由此設(shè)想ZC3H13是否通過控制復(fù)合物中其他成分的細(xì)胞定位從而調(diào)控m6A生成,。通過分餾分析實(shí)驗(yàn),，發(fā)現(xiàn)在對照的小鼠干細(xì)胞中，WTAP,、Virlizer,、Hakai均存在與細(xì)胞核內(nèi)，而在干擾的ZC3H13的細(xì)胞中,，卻發(fā)現(xiàn)上述三種蛋白的出現(xiàn)在了細(xì)胞質(zhì)中,，此外在該細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)的Mettl3和Mettl14均減少，在重新導(dǎo)入ZC3H13蛋白到該細(xì)胞中后,，可以對于上述復(fù)合物的蛋白進(jìn)行重新細(xì)胞定位,。上述結(jié)果說明該蛋白對于WTAP、Virlizer,、Hakai及Mettl3和Mettl14蛋白的細(xì)胞定位是必須的,，然后與之相反的結(jié)論卻不成立。 進(jìn)一步的通過WTAP抗體進(jìn)行的對于干擾ZC3H13細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)合物進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),，證實(shí)ZC3H13蛋白只影響復(fù)合物相關(guān)蛋白的細(xì)胞定位,，而不影響復(fù)合物的形成。接下來,，針對兩種細(xì)胞類型的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的m6A數(shù)據(jù)比較,，超過75%的水平降低的m6A peaks在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈現(xiàn)保守狀態(tài)。上述實(shí)驗(yàn)說明,，雖然WTAP,、Virlizer、Hakai轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中,，并仍然可以與Mettl3和Mettl14形成復(fù)合物,，但是他們不能在ZC3H13缺失狀況下促進(jìn)m6A的生成。由此說明細(xì)胞核對于m6A的調(diào)控生成意義重大,。   博淼生物科技 ： 更多深度m6A科研方案及檢測技術(shù)資料介紹，隨時歡迎與我們相約講座,。400-6506-908等著您,！  野子 撰文 本文為博淼生物原創(chuàng) |
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