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編譯：Yong-qin，編輯：十九,、江舜堯,。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載,。 水稻（Oryza sativa）是人類重要的糧食作物之一,，非生物脅迫會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和表型，其中鹽脅迫對(duì)作物生長(zhǎng)起不利影響,。干旱條件（極端環(huán)境）對(duì)水稻生長(zhǎng)造成不可逆損害,，降低作物產(chǎn)量和品質(zhì)；高溫脅迫則影響水稻開花,，降低作物產(chǎn)量,。而植物內(nèi)進(jìn)化出各種調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生非生物脅迫的抗性，包括轉(zhuǎn)錄因子（TFs）,。 水稻中,，共有2408個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，分為56個(gè)基因家族,。其中AP2/ERF（乙烯響應(yīng)因子）,、bZIP（堿性亮氨酸拉鏈）、NAC,、MYB,、WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中發(fā)揮作用,。擬南芥中過表達(dá)AtNAC07、AtNAC019,、AtNAC055可增強(qiáng)耐旱性,，AtNAC2則與乙烯信號(hào)通路有關(guān)，影響植株側(cè)根發(fā)育,。水稻中OsNAC67的表達(dá)與耐鹽性和耐旱性有關(guān),，而玉米中ZmSNAC1基因與耐旱性有關(guān)。 CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)被應(yīng)用于水稻上的多種重要基因,，對(duì)育種和了解基因功能具有重要意義,。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)由T-DNA插入載體介導(dǎo)，而CRISRP/Cas9的優(yōu)點(diǎn)在于其準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)便性,，并且產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因株系,，但突變植株經(jīng)過幾代性狀分離后會(huì)丟失CRISRP/Cas9載體。 本研究克隆了水稻上一個(gè)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因OsNAC006,，并表明該基因的突變會(huì)影響水稻耐旱性和耐熱性,。 論文ID 原名：Knockout of the OsNAC006 Transcription Factor Causes Drought and Heat Sensitivity in Rice 譯名：OsNAC006轉(zhuǎn)錄因子影響水稻耐熱性和耐旱性 期刊：International Journal of Molecular Sciences IF：4.183 發(fā)表時(shí)間：2020.03 通訊作者：陳成彬 通訊作者單位：南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 DOI號(hào)：10.3390/ijms21072288 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ① 植物材料。粳稻品種'日本晴’的野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因（OsNAC006）株系,。干旱脅迫采用不灌溉7d處理,，高溫脅迫采用42℃培養(yǎng)處理。 ② RT-qPCR,。定量測(cè)定干旱和高溫脅迫下OsNAC006的表達(dá)模式,。 ③ 亞細(xì)胞定位。構(gòu)建pZmUbi::OsNAC006-eGFP::HspT載體整合到水稻原生質(zhì)體,，通過GFP確定OsNAC006在細(xì)胞內(nèi)的位置,。 ④ CRISPR-Cas9誘變及分析。CRISPR-Cas9載體（pZHY988）靶向OsNAC006基因,，導(dǎo)入農(nóng)桿菌后感染水稻愈傷組織。選擇4周苗期的幼苗進(jìn)行生理學(xué)測(cè)定,。5周苗期的干旱脅迫的幼苗進(jìn)行RNA-seq,。 結(jié)果 1、OsNAC006的表達(dá)譜和亞細(xì)胞定位 本試驗(yàn)分析OsNAC006基因在水稻8個(gè)組織（幼苗的根/莖/葉,、抽穗期的根/莖/鞘/葉/穗）的表達(dá)水平,，提取RNA進(jìn)行RT-qPCR。結(jié)果表明,，OsNAC006在幼苗和抽穗期的各個(gè)組織均有表達(dá),，莖和葉中的表達(dá)量最高（圖1A）。通過GFP信號(hào)檢測(cè)OsNAC006在原生質(zhì)中的定位（eGFP為陰性對(duì)照）,，共焦顯微鏡圖像顯示OsNAC006定位于細(xì)胞核（NLS為核標(biāo)記物）（圖1B）,。 此外,，研究者評(píng)估了OsNAC006是否受非生物脅迫及外源激素等的影響。結(jié)果表明,，H2O2,、NaCl、PEG-6000的處理下,，OsNAC006的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,，而高溫和低溫脅迫均使OsNAC006的轉(zhuǎn)錄水平先升高后下降。外源激素IAA,、GA處理使OsNAC006的表達(dá)水平在3h和6h后達(dá)到峰值,，而ABA處理導(dǎo)致其表達(dá)水平逐漸上升（圖1C）。這表明OsNAC006的表達(dá)差異受不同的非生物脅迫的影響不同,。 2,、OsNAC006突變株的產(chǎn)生 由于NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在水稻中的作用研究較少,，因此本研究嘗試探索OsNAC006基因的生物學(xué)作用。為研究OsNAC006在外界脅迫下的作用,，作者使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除OsNAC006基因,，根據(jù)plantTFDB數(shù)據(jù)庫的基因序列信息，設(shè)計(jì)sgRNA靶向OsNAC006的第一個(gè)外顯子（圖2A）,，在選擇10株經(jīng)CRISPR/Cas9處理的第一代植株,，進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)6株成功的等位基因突變,，以及1株雜合突變（圖2B）,。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，突變序列包括插入單堿基對(duì)（+1bp/+1bp）,、缺失單堿基對(duì)（-1bp/-1bp）,、缺失大片段堿基對(duì)（-55bp/-55bp）（圖2C）。在正常生長(zhǎng)條件下,，三種突變株和野生型表現(xiàn)相似的表型和生長(zhǎng)狀態(tài)（圖2D）,。 圖2 CRISPR/Cas9產(chǎn)生的OsNAC006突變株。（A）sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn),；（B）10株突變株的突變位點(diǎn)多態(tài)性,；（C）突變位點(diǎn)的序列；（D）突變株的表型,。 3,、OsNAC006突變株的耐熱性和耐旱性 非生物脅迫處理后，OsNAC006突變株的表型表明水稻耐熱性和耐旱性被抑制（圖3A和D）,。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),，NBT染色（檢測(cè)超氧物歧化酶活性）和DAB（檢測(cè)過氧化物酶活性）染色,，在正常條件下野生型和突變體無差異，而干旱或高溫脅迫下可看出突變株的O2-和H2O2含量較高（圖3B和E）,。在干旱和高溫脅迫下,，突變植株的葉綠素含量明顯降低，抗氧化酶（SOD,、POD,、CAT）活性降低，丙二醛（MDA,，一種膜脂過氧化的標(biāo)志物）含量上升（圖3C和F）,。這些結(jié)果表明OsNAC006在水稻中的作用可能是在干旱和高溫脅迫下，通過削弱植株內(nèi)抗氧化反應(yīng),，并介導(dǎo)光合作用,，從而賦予植株耐旱和耐熱性。 圖3 干旱/高溫環(huán)境下OsNAC006敲除對(duì)水稻表型和生理生化的影響,。 4,、OsNAC006基因敲除對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組的影響 本研究為探究在干旱脅迫下受OsNAC006調(diào)控的基因，作者選擇干旱條件和正常條件下的野生型（WT）,、55bp缺失的突變株（osnac006_1）,、突變株自交后代（osnac006_2）進(jìn)行RNA-seq，共6個(gè)樣品,。參考基因組平均比對(duì)率為88.67%,，鑒定基因共32482個(gè)，并檢測(cè)到新的轉(zhuǎn)錄本15871個(gè),，其中12778個(gè)預(yù)測(cè)為已知蛋白編碼基因的可變剪接新亞型,，570個(gè)為假定蛋白。RNA-seq結(jié)果顯示,，干旱脅迫對(duì)水稻的基因表達(dá)帶來顯著改變（圖4A和C）,。與野生型相比，在正常條件下,，突變株osnac006_1有4832個(gè)基因上調(diào),，1512個(gè)基因下調(diào)；osnac006_2有1814個(gè)基因上調(diào),，2833個(gè)基因下調(diào)（圖4B）。干旱脅迫下,，osnac006_1上調(diào)基因527個(gè),，下調(diào)1209個(gè)；osnac006_2上調(diào)基因1412個(gè),，下調(diào)基因1091個(gè)（圖4D）,。篩選這兩種突變體共有的差異表達(dá)基因（DEGs）,，發(fā)現(xiàn)正常條件下有1661個(gè)，干旱脅迫下有793個(gè),，分別進(jìn)行GO富集分析,。富集分析分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞膜,、細(xì)胞器的功能,，功能類別富集于氧化還原酶活性、結(jié)合輔助因子,、調(diào)控因子,，生物學(xué)功能富集于氧化還原、多細(xì)胞生物過程,、脅迫響應(yīng),。其中，脅迫響應(yīng),、細(xì)胞器相關(guān),、氧化還原酶活性的編碼基因表達(dá)差異較顯著（圖4E）。 5,、干旱脅迫下OsNAC006對(duì)水稻的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 通過對(duì)突變體的差異表達(dá)基因的富集分析，確定了12個(gè)富集區(qū),。KEGG富集分析則表明,，受影響的代謝途徑包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、二萜類生物合成,、類胡蘿卜素生物合成、光合酶,、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,、淀粉和蔗糖代謝。根據(jù)KEGG富集結(jié)果,，我們選擇4個(gè)最顯著的途徑進(jìn)行細(xì)化的差異分析,。結(jié)果表明，受影響的植物激素關(guān)鍵基因包括油菜素類固醇受體基因（Os01g0718300/Os05g0207500）,、乙烯響應(yīng)因子（Os02g0820900）,、生長(zhǎng)素應(yīng)答因子（Os04g0671900/Os06g0702600）、ABA結(jié)合因子（Os06g0211200）（圖5A）,。Os03g0685000是一個(gè)光合作用相關(guān)酶的基因,，參與電子傳遞鏈，影響氧化還原過程（圖5B）,。Os02g0110200是編碼過氧化物裂解酶的基因,，Os03g0767000是編碼過氧化物脫水酶中與血紅素鐵結(jié)合的活性部位的基因（圖5C）,。干旱脅迫處理也影響了細(xì)胞膜細(xì)胞膜相關(guān)的二萜類代謝和氧化還原酶的活性（圖5D）。 討論 干旱脅迫是危害作物產(chǎn)量的重要因素,，全球約20%作物受干旱影響。研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆性方面起重要作用,。水稻OsNAC2的表達(dá)會(huì)抑制其耐鹽和耐旱性,。本研究則發(fā)現(xiàn)OsNAC006基因受多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，如非生物脅迫和激素脅迫,。OsNAC006突變體對(duì)干旱和高溫的耐受性降低,，葉綠素含量下降，POD和SOD酶活性降低,，這些抗氧化酶活性與植物耐受性相關(guān),。RNA-seq發(fā)現(xiàn)脅迫響應(yīng)途徑最受影響的是植物激素信號(hào)途徑和絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號(hào)途徑，先前研究表明擬南芥絲裂原激活蛋白激酶基因受茉莉酸誘導(dǎo),，影響植物耐旱性和抗病性,。 綜上，本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為OsNAC006在水稻耐旱性中發(fā)揮作用提供論證,。OsNAC006基因定位于細(xì)胞核內(nèi),，受多種非生物脅迫和激素誘導(dǎo)，它調(diào)控植物抗逆性,、氧化還原酶活性,、輔助因子結(jié)合、細(xì)胞膜相關(guān)的基因表達(dá),。這一結(jié)論為揭示植物抗旱性的分子機(jī)制提供參考,。 評(píng)論 水稻在生長(zhǎng)過程中會(huì)受到各種非生物脅迫，而植物特有的的NAM,、ATAF,、NAC家族轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要作用，然而目前水稻中約有170個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子功能未知,。本研究發(fā)現(xiàn)OsNAC006基因受H2O2,、溫度脅迫、植物激素的誘導(dǎo),，并影響植物的耐旱性和耐熱性,。轉(zhuǎn)錄組分析則發(fā)現(xiàn)OsNAC006調(diào)控水稻應(yīng)激反應(yīng)、氧化還原酶活性、輔助因子結(jié)合,、細(xì)胞膜相關(guān)的基因表達(dá)。該結(jié)論表明了OsNAC006基因?qū)χ参锟鼓嫘缘闹匾饔谩?/span> 更多推薦 1 科研 | PNAS：轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示急性和慢性飲酒對(duì)肝臟晝夜新陳代謝有不同的影響
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