題目：DROUGHT-INDUCED BRANCHED-CHAIN AMINO ACID AMINOTRANSFERASE enhances drought tolerance in rice

刊名：Plant Physiology

作者：Jun Sung Seo, Ju-Kon Kim et al.

單位：Seoul National University, Pyeongchang

日期：09 December 2022

01

摘要

植物積累多種代謝物以應(yīng)對(duì)干旱脅迫,，包括支鏈氨基酸 (BCAA)。然而,，BCAA 在植物干旱反應(yīng)中的作用以及 BCAA 積累的潛在分子機(jī)制仍然不清楚。在這里,，我們證明水稻 ( Oryza sativa ) 干旱誘導(dǎo)的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶 (OsDIAT) 介導(dǎo)水稻中支鏈氨基酸的積累以應(yīng)對(duì)干旱脅迫,。體外酶活性測(cè)定表明 OsDIAT 是一種支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，亞細(xì)胞定位分析表明 OsDIAT 定位于細(xì)胞質(zhì),。OsDIAT的表達(dá)在暴露于非生物脅迫的植物中被誘導(dǎo),。OsDIAT -過度表達(dá)（OsDIAT OX) 植物對(duì)干旱脅迫的耐受性更強(qiáng)，而與非轉(zhuǎn)基因 (NT) 植物相比,， 過表達(dá)OsDIAT植物對(duì)干旱脅迫更敏感,。氨基酸分析表明，與 NT 植物相比,，OsDIAT OX中的 BCAA 水平較高,，但在osdiat-OE中較低。最后,，與對(duì)照植物相比,，BCAAs 的外源應(yīng)用提高了植物對(duì)滲透脅迫的耐受性?？偟膩碚f,，這些發(fā)現(xiàn)表明 OsDIAT 通過促進(jìn) BCAAs 的積累來介導(dǎo)耐旱性。

02

技術(shù)路線

將水稻（Oryza sativa“Donjin”）種子播種在Murashige和Skoog（MS）固體培養(yǎng)基上,，并在28°C的黑暗中孵育4天,。

Phylogenetic analysis

質(zhì)粒構(gòu)建與水稻轉(zhuǎn)化

RNA isolation and reverse transcription quantitativePCR

細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)

水稻原生質(zhì)體的制備及瞬時(shí)基因表達(dá)

Enzyme activity assay

干旱脅迫處理與抗旱性評(píng)價(jià)

田間水稻農(nóng)藝性狀的評(píng)價(jià)、氨基酸喂養(yǎng)和PEG處理

03

主要結(jié)果

3.1 OsDIAT是一種干旱誘導(dǎo)基因,，編碼細(xì)胞質(zhì)BCAT BCAA

BCAT是很強(qiáng)的候選酶,，可能在非生物脅迫條件下導(dǎo)致BCAA水平升高。系統(tǒng)發(fā)育分析將推測(cè)的水稻BCAT基因分為兩個(gè)不同的亞組,。OsDIAT（Os05g0244700）屬于具有兩個(gè)額外推定BCAT基因（Os01g0238500和Os02g0273100）的亞組,，而其他五個(gè)基因與擬南芥質(zhì)體BCAT形成另一個(gè)亞組。我們基于先前報(bào)道的RNA測(cè)序數(shù)據(jù),，研究了干旱條件下這些推定BCAT基因的表達(dá)模式,。在這20個(gè)基因中，有8個(gè)基因在干旱條件下表現(xiàn)出兩倍以上的表達(dá)變化,。OsDIAT的表達(dá)變化在8個(gè)基因中最為顯著,；因此,，我們專注于OsDIAT而不是其他基因。OsDIAT表達(dá)在干旱處理后1天被誘導(dǎo),，在干旱處理之后2-3天被進(jìn)一步誘導(dǎo),。

為了驗(yàn)證OsDIAT在干旱和其他非生物脅迫條件下的表達(dá)誘導(dǎo)，我們使用暴露于干旱,、高鹽和低溫條件的植物葉片和根部的總RNA進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）分析（圖1A–C）,。干旱條件下，OsDIAT表達(dá)在葉片和根中均顯著誘導(dǎo),，在葉片中誘導(dǎo)更強(qiáng)（圖1A）,。高鹽度和低溫處理的非生物脅迫條件也誘導(dǎo)了OsDIAT在葉片組織中的表達(dá)（圖1，B和C）,。因此,，OsDIAT的表達(dá)主要是由非生物脅迫誘導(dǎo)的。干旱條件下BCAA積累需要ABA,。

為了研究ABA在調(diào)節(jié)OsDIAT表達(dá)中的潛在作用,，我們分析了OsDIAT的啟動(dòng)子區(qū)域，并在2kb啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)鑒定了兩個(gè)ABA響應(yīng)元件（補(bǔ)充圖2A）,。為了檢查OsDIAT對(duì)ABA處理的反應(yīng),，我們進(jìn)行了RT-qPCR分析（圖1D）。作為陽性對(duì)照,，我們使用了水稻脫水誘導(dǎo)蛋白1（OsDIP1）,，其表達(dá)隨著ABA的反應(yīng)而增加。OsDIAT表達(dá)在葉片和根中都表現(xiàn)出對(duì)ABA處理的劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo),，OsDIP1也是如此（圖1D）,。我們通過執(zhí)行時(shí)空表達(dá)譜研究了OsDIAT表達(dá)的發(fā)育調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)OsDIAT在根中比在其他組織中表達(dá)更高（圖1E）,。由于BCAT的功能取決于它們?cè)谥参镏械膩喖?xì)胞定位,，我們檢查了OsDIAT的亞細(xì)胞位置。通過電子分析預(yù)測(cè)OsDIAT是細(xì)胞質(zhì)定位,，我們?cè)?5S啟動(dòng)子（35S：：OsDIAT-GFP）的控制下生成了表達(dá)OsDIAT與綠色熒光蛋白（GFP）翻譯融合的編碼序列的構(gòu)建體,。我們?cè)谒局兴矔r(shí)表達(dá)了這個(gè)質(zhì)粒。在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到GFP信號(hào),，但在線粒體中沒有檢測(cè)到,，線粒體是BCAA降解的位點(diǎn)（圖1F）。

為了研究OsDIAT的動(dòng)力學(xué)財(cái)產(chǎn),，在大腸桿菌中表達(dá)并純化了該蛋白,。用重組OsDIAT在正向（合成）和反向（降解）方向上進(jìn)行酶測(cè)定。表1顯示了所有六種支鏈底物的動(dòng)力學(xué)值,。OsDIAT在正向表現(xiàn)出比反向更高的效率,，對(duì)BCKA的親和力比BCAA高,。總之,，這些結(jié)果表明OsDIAT是一種干旱誘導(dǎo)的胞漿BCAT,，它將α-酮酸轉(zhuǎn)化為BCAA。

3.2 OsDIAT介導(dǎo)抗旱性

為了研究OsDIAT在干旱條件下在水稻中的生物學(xué)功能，我們產(chǎn)生了OsDIAT過度表達(dá)和OsDIAT突變體植物,。在產(chǎn)生的70個(gè)獨(dú)立的OsDIAT過表達(dá)轉(zhuǎn)基因系中,，我們選擇了沒有表現(xiàn)出發(fā)育不良的植物，以消除體細(xì)胞克隆變異的影響,?；贠sDIAT在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，我們選擇了四個(gè)獨(dú)立的單拷貝純合轉(zhuǎn)基因系（OsDIATOX#1,、#5,、#13和#60）進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖2A）。為了檢查植物在營(yíng)養(yǎng)階段在干旱條件下的表現(xiàn),，我們?cè)跍厥抑蟹N植了選定的OsDIATOX和非轉(zhuǎn)基因（NT）植物4周,，并通過抑制水分使其暴露于干旱脅迫（圖2，B–E）,。土壤含水量（干旱處理的一個(gè)指標(biāo)）在整個(gè)植物中顯示出相似的下降速度,，證實(shí)了脅迫處理是均勻應(yīng)用的（圖2B）。干旱處理期間,，NT植物比OsDIATOX植物更早出現(xiàn)干旱誘導(dǎo)癥狀,，如萎蔫、卷葉和黃化（圖2C）,。OsDIATOX植物在通過重新澆水緩解干旱脅迫后,，與NT植物相比，恢復(fù)率也更好（圖2,，C和D）,。OsDIATOX植物在重新澆水后7天顯示出82%至93%的存活率，而NT植物僅顯示出40%的存活率（圖2D）,。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證植物在干旱條件下的表現(xiàn),，在暴露于干旱脅迫的植物中測(cè)量了Fv/Fm值,，該值是光系統(tǒng)II光化學(xué)效率的指標(biāo)。NT植物中的Fv/Fm值在干旱處理后5天開始迅速下降,，而OsDIATOX植物中的值在處理后9天顯示下降（圖2E）,。盡管OsDIATOX轉(zhuǎn)基因系中OsDIAT表達(dá)水平不同，但所有轉(zhuǎn)基因系均表現(xiàn)出相似的耐旱表型（圖2C–E）,，這表明#5和#60系的表達(dá)水平已經(jīng)足夠高,，足以滿足性能要求，轉(zhuǎn)基因系之間的表達(dá)差異并未實(shí)質(zhì)上影響性能,。

我們還研究了osdiat植物的干旱反應(yīng),。我們通過CRISPR（簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列）/Cas9（CRISPR相關(guān)蛋白9）介導(dǎo)的基因編輯和兩個(gè)獨(dú)立的單引導(dǎo)RNA產(chǎn)生了四個(gè)獨(dú)立的osdiat突變體（圖3A）,。每個(gè)突變體在OsDIAT基因座中顯示出不同的突變、缺失和插入模式,。RT-qPCR結(jié)果表明,，osdiat突變體仍然產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物；然而,，測(cè)序結(jié)果表明它們是異常轉(zhuǎn)錄物,。osdiat植物比NT植物更容易受到干旱處理的時(shí)間過程的影響（圖3B），而osdiat和NT植物的土壤水分含量都降低到了相似的水平（圖3C）,。osdiat植物在干旱處理后的存活率低于NT對(duì)照植物（圖3D）,。與NT植物相比，osdiat植物的Fv/Fm值開始更快地下降（在干旱處理后2天）（圖3E）,。這些結(jié)果表明,，OsDIAT是水稻干旱反應(yīng)所必需的，過表達(dá)OsDIAT可增強(qiáng)植物在營(yíng)養(yǎng)階段的抗旱性,。

3.3 OsDIAT的過度表達(dá)提高了田間干旱條件下的糧食產(chǎn)量

產(chǎn)量成分,，包括籽粒灌漿速率,、數(shù)量和重量，是用于評(píng)估植物在生殖階段耐旱性的基本標(biāo)準(zhǔn),。為了測(cè)試OsDIATOX轉(zhuǎn)基因植物在生長(zhǎng)繁殖階段的抗旱性,，我們?cè)u(píng)估了OsDIATOS植物在田間正常和干旱條件下的產(chǎn)量參數(shù)。我們?cè)诘咎镏蟹N植了四個(gè)獨(dú)立的T5純合OsDIATOX系和NT株植物,，并對(duì)每個(gè)獨(dú)立系30株植物的產(chǎn)量參數(shù)進(jìn)行了兩次重復(fù)（圖4,，a和B）。與NT植物相比,，OsDIATOX植物在生殖階段暴露于干旱脅迫條件下,，其總粒重、灌漿速率和灌漿粒數(shù)顯著增加（圖4B）,。具體而言，OsDIATOX植物的總粒重比NT植物高25%-29%,。同樣,，OsDIATOX植物的籽粒灌漿率和灌漿粒數(shù)顯著高于NT植物（分別高出21%-37%和34%-44%）。另一方面,，與正常生長(zhǎng)條件下的NT植物相比,，OsDIATOX植物在產(chǎn)量參數(shù)方面沒有表現(xiàn)出顯著差異，盡管轉(zhuǎn)基因系之間存在一些差異（圖4A）,。干旱條件下OsDIATOX植物產(chǎn)量成分的顯著增加表明,，OsDIAT的過度表達(dá)增強(qiáng)了干旱耐受性，并減輕了繁殖階段干旱脅迫的損害,。

3.4 OsDIATOX葉片中BCAA水平顯著升高

當(dāng)植物暴露于干旱脅迫時(shí)，BCAA會(huì)積累,，但BCAA積累是否直接有助于抗旱性之前尚未進(jìn)行測(cè)試,。為了檢查BCAA含量對(duì)耐旱性的影響，我們測(cè)量了NT植物在正常和干旱條件下的BCAA水平（圖5）,。在正常條件下,，NT植物葉片和根組織中的BCAA水平是可比較的。然而,，在干旱脅迫條件下,，兩種組織中的BCAA水平顯著較高（圖5A-F）。這些結(jié)果證實(shí)了植物在干旱脅迫下積累BCAA的發(fā)現(xiàn),。然后,，我們分析了OsDIATOX和osdiat植物中的BCAA水平，以確定osdiat過表達(dá)或突變是否改變了植物中BCAA的積累（圖5A-F）,。在正常生長(zhǎng)條件下,，OsDIATOX的葉片組織中的BCAA水平顯著高于NT植物，并且當(dāng)兩組都暴露于干旱脅迫時(shí),，OsDIATOX植物中的BCAA水平進(jìn)一步增加（圖5,，A和E）。相比之下,，OsDIATOX植物根組織中的BCAA水平與正常生長(zhǎng)條件下的NT植物保持相似,，盡管在干旱脅迫條件下OsDIATOS的BCAA高于NT根（圖5B）。有趣的是,，osdiat植物的葉和根組織中的BCAA水平與正常生長(zhǎng)條件下的NT植物相似（圖5,，C和D），但顯著低于干旱條件下的NT植物（圖5、C,、D和F）,。這些結(jié)果表明，干旱誘導(dǎo)了植物中BCAA的積累,，OsDIAT介導(dǎo)了這一過程,。

3.5 外源BCAA增強(qiáng)滲透脅迫耐受性

為了研究BCAA對(duì)滲透脅迫耐受性的影響,，我們檢查了在PEG處理驅(qū)動(dòng)的滲透脅迫條件下，用外源BCAA處理的植物的反應(yīng)（圖6）,。為了提高內(nèi)部BCAA水平,，用丙氨酸（陰性對(duì)照）、亮氨酸,、異亮氨酸,、纈氨酸或脯氨酸（陽性對(duì)照）預(yù)處理根。我們使用HPLC分析了用外源BCAA預(yù)處理的植物中的BCAA水平,。外源性施用BCAA導(dǎo)致葉組織和根組織中相應(yīng)的BCAA水平增加（圖6,，A和B）。為了研究外源施用BCAA誘導(dǎo)的植物增強(qiáng)的耐旱性,，我們將用BCAA預(yù)處理的植物轉(zhuǎn)移到PEG溶液中,，并監(jiān)測(cè)滲透脅迫誘導(dǎo)的癥狀,。在PEG處理期間,，與用BCAA或脯氨酸預(yù)處理的植物相比，模擬處理的植物和用丙氨酸預(yù)處理的植株中,，滲透脅迫相關(guān)癥狀（如葉片卷曲和萎蔫）出現(xiàn)得更早（圖6C）,。用BCAA或脯氨酸預(yù)處理的植物的相對(duì)含水量（RWC）顯著高于模擬處理的植物或用丙氨酸預(yù)處理的植株（圖6D）。BCAA預(yù)處理還提高了植物通過轉(zhuǎn)移到正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中而從滲透脅迫中緩解后的恢復(fù)（圖6E）,。最后,，我們通過分析OsDIP1的表達(dá)來監(jiān)測(cè)PEG處理引起的脫水應(yīng)激程度。在PEG處理期間,，在用BCAA預(yù)處理的植物中誘導(dǎo)OsDIP1表達(dá),，但用BCAA或脯氨酸預(yù)處理的植株中的OsDIP1誘導(dǎo)水平低于模擬處理的植株或用丙氨酸預(yù)處理的作物（圖6F）。此外,，恢復(fù)后,，用BCAA預(yù)處理的植物中OsDIP1的表達(dá)水平低于模擬對(duì)照植物（圖6F）,。這些結(jié)果表明，BCAA的積累足以誘導(dǎo)植物的滲透脅迫耐受性,。

04

結(jié)論

在本研究中,，我們研究了水稻干旱誘導(dǎo)的支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（OsDIAT）在BCAA生物合成和抗旱性中的分子功能，OsDIAT是屬于轉(zhuǎn)氨酶IV家族的水稻BCAT,。OsDIAT的過度表達(dá)導(dǎo)致在正常和干旱條件下BCAA的積累增加,。與野生型相比，OsDIAT過表達(dá)（OsDIAT OX）植物在干旱條件下表現(xiàn)出更高的存活率和糧食產(chǎn)量,。相比之下,，osdiat植物積累的BCAA較少，對(duì)干旱脅迫的耐受性降低,。最后,，外源施用BCAA增強(qiáng)了植物對(duì)聚乙二醇（PEG）驅(qū)動(dòng)的滲透脅迫的耐受性。這些結(jié)果表明,，OsDIAT調(diào)節(jié)BCAA的干旱誘導(dǎo)積累,，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗旱性。

我們提供了BCAA賦予植物耐旱性的直接遺傳證據(jù),。我們還確定了一個(gè)具有高BCAA含量和增強(qiáng)抗旱性的工程作物的有價(jià)值的候選基因,。

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