基因敲除是生物領(lǐng)域開展研究的重要手段,，而同源重組是最經(jīng)典、應(yīng)用非常廣泛的一種敲除方法,。顧名思義,，同源重組就是利用同源片段將目的基因截短,、刪除或者替換,，使基因失活從而實現(xiàn)敲除的目的。

這里,，以細菌為例，介紹用敲除質(zhì)粒將基因截短的原理，過程可以分為兩大部分：單交換（發(fā)生一次交換）和雙交換（發(fā)生兩次交換）,。

這里用藍色表示基因組，將要敲除的目的基因分成三段：A,、B、C,。B是要截去的片段（有時可能基因較短,，選取時可以延伸到基因上下游間區(qū)）；用黃色表示構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒,，A和C我們稱為上,、下游同源臂，將目的基因的B段敲除,，利用的就是質(zhì)粒和基因組的A,、C同源臂發(fā)生同源重組（至于為什么需要兩個同源臂，看完整個過程你就會明白啦）,。

因為有兩個同源臂,，所以單交換的發(fā)生有兩種情況，即發(fā)生在A,，或發(fā)生在C,。在這里，我們先列出一種情況——發(fā)生在A,，讓我們把目光聚焦到A上：

敲黑板劃重點,！

同源重組是發(fā)生在兩段同源序列上（同源說簡單點就是相似度很高，體現(xiàn)在這里就是正義鏈和正義鏈,，反義鏈和反義鏈）,，所以過程中圖里的5’和3’端大家一定要看好啦。

此A牽起彼A的手說：初次見面請多關(guān)照啊~

從平面圖來看,，就是將下半部分像擰麻花一樣逆時針擰一下,，形成了“井”字，即Holiday結(jié)構(gòu),。

Holiday結(jié)構(gòu)有兩種拆分方式：

左圖即質(zhì)粒成功整合到基因組,，發(fā)生單交換。

在此單交換的基礎(chǔ)上,，同源臂再次發(fā)生重組,，有兩種情況——在同源臂A發(fā)生重組、在同源臂C發(fā)生重組,。

為了方便大家看,，把單交換橫過來：

交換過后前端來自質(zhì)粒的A用黃色表示，前端來自基因組的A用藍色表示：

接下來又要開始找朋友啦~

賊開心

為什么會扭成這個樣子,？

因為兩段同源的序列才會發(fā)生重組（友情提示：上一個圖中外側(cè)兩條鏈是同源,，同樣，內(nèi)側(cè)兩條鏈也是）。

接下來的交換過程和單交換是一樣的：

拆分結(jié)果顯而易見,，左圖基因組上的基因還是ABC,，并沒有截短，右圖還是單交換的狀態(tài),，所以,，單交換發(fā)生在A，雙交換也發(fā)生在A是不能成功敲除目的基因的,。

那么,，雙交換發(fā)生在C呢？

讓我們把目光聚焦到C上：

黃色表示質(zhì)粒上的C,，藍色表示基因組上的C,。接下來的過程和雙交換發(fā)生在A是一樣的：

可以看到，左圖基因組上的基因變成了AC,，說明敲除成功,；右圖仍然保持單交換狀態(tài)。

總結(jié)

如果單交換發(fā)生在A,，雙交換只有發(fā)生在C,，才能達到敲除的目的；同樣,，如果單交換發(fā)生在C,，那么雙交換發(fā)生在A，基因才能敲除成功哦~ 說到這里,，大家知道為什么要設(shè)計上下游兩個同源臂了吧,！

當然，敲除質(zhì)粒是多種多樣的,，一般都帶有抗性等一些篩選標記以便篩選出單交換,，也同時會有些致死基因在篩選雙交換的時候起作用；同樣,，替換的原理跟截短是一樣的,，萬變不離其宗。