Single-cell RNA-seq dissects the intratumoral heterogeneity of triple negative breast cancer based on gene regulatory networks

基于單細胞RNA-seq構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析三陰性乳腺癌異質(zhì)性

乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一,，通常伴有較高的瘤內(nèi)異質(zhì)性。傳統(tǒng)上,，乳腺癌患者根據(jù)ER(雌激素受體),、PR 40(孕激素受體)和HER2(人表皮生長因子受體-2)狀態(tài)的免疫組化特征，可分為luminal A型,、luminal B型,、HER2+型和basal-like型。4個亞型的病理特征和預(yù)后結(jié)果有很大差異,。大多數(shù)基底樣乳腺癌表現(xiàn)為三陰性表型,。與其他亞型相比，三陰性乳腺癌(TNBC)總是具有更高的轉(zhuǎn)移概率和較差的預(yù)后,。已有研究表明乳腺癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤耐藥的主要原因,，基于65個scRNA-seq數(shù)據(jù)的TNBC網(wǎng)絡(luò)分析可以幫助我們剖析在腫瘤發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的風險基因。

利用基因表達譜和基因組信息推斷scRNA-seq數(shù)據(jù)中868個上皮細胞的CNVs，然后利用推斷的CNVs將上皮細胞聚為3個不同的亞群,。發(fā)現(xiàn)亞群1和亞群3的CNV數(shù)量較多,，分別由134和411個細胞構(gòu)成,，因此推測這兩個集群可能是惡性細胞。亞群2中的細胞CNV數(shù)量較少,，由323個細胞組成(圖1A和1B),，可能為非惡性細胞。接下來使用tSNE (t-Distributed  random Neighbor Embedding)進行降維,。結(jié)果顯示上皮細胞被很好地分成四個不同的亞群(圖1C),，這證實了層次聚類的結(jié)果。

圖1.TNBC患者的細胞分型

使用PAM450模型將惡性上皮細胞分為5個分子亞型,，分別為Normal-like,、Basal-like、Her2+,、LumA和LumB（在圖1D）,。發(fā)現(xiàn)6例患者的亞型組成具有很大的多樣性。PT039和PT081由相當高的基底層樣亞型細胞組成,。檢查患者的臨床資料患者發(fā)現(xiàn)PT039和PT081顯示出相對較大的腫瘤大小(圖1E),，這表明基底樣亞型的高成分可能與乳腺癌患者的進展有關(guān)。

為了研究TNBC腫瘤微環(huán)境中的細胞-細胞相互作用網(wǎng)絡(luò),，使用python CellPhoneDB包分析不同細胞類型中配體-受體相互作用,。p < 0.05的配體-受體對103被認為在兩種細胞類型中具有顯著的相互作用。發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在細胞-細胞通訊網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用(圖2A),，這揭示了巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的重要作用,。在基底樣乳腺癌細胞系中，自分泌信號AREG的調(diào)節(jié)被證實有助于巨噬細胞的募集,。然后對5個分子亞型進行了基因集變異分析(GSVA),，鑒定50個HALLMARK基因集中的細胞活性。發(fā)現(xiàn)這5個分子亞型具有很大的多樣性(圖2B),，揭示了不同分子亞型在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性,。

圖2.細胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)和GSVA分析

基于基因表達譜和tf結(jié)合基序信息構(gòu)建正常上皮細胞和5個分子亞型特異性GRNs。首先,，計算顯著共表達的tf -基因?qū)?。其次，將顯著富集tf結(jié)合基序的靶基因保留下來,，以供進一步研究,。最后，富集評分(ES) > 1被認為是構(gòu)建GRN的顯著TF-target 對(表1),。

表1.6個GRNs的TF-target數(shù)量

構(gòu)建的GRNs發(fā)現(xiàn)個正常上皮細胞和5個分子亞型GRNs均近似符合冪律分布,，表明這6個GRN存在高度連接的核心節(jié)點。發(fā)現(xiàn)在每個亞型特異性GRNs中,，TFs的程度都有很大的差異,。此外,，在5個分子亞型特異性GRNs中沒有任何規(guī)則(TF-target)保守，但在5個GRNs中有10個保守調(diào)控因子(TFs),。提出這些保守的TFs在不同的分子亞型中發(fā)揮不同的作用,，可能與腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性有關(guān)。

圖3.5個分子亞型特異性GRNs

作者評估了6個GRNs中的關(guān)鍵基因：首先,，作者使用中心指標評估基因的重要度。中心指標包括點度中心性（degree）,、中介中心性（betweenness）,、接近中心性（closeness）、特征值（eigenvalue）和pageRank,。然后將Q值排名前1%的基因定義為關(guān)鍵基因,，接下來從cancer Gene Census獲得已知的癌癥基因來評估這些關(guān)鍵基因是否在癌癥基因中富集。發(fā)現(xiàn)分子亞型特異性GRN中的關(guān)鍵基因在已知的腫瘤基因中顯著富集每個亞型中涉及已知癌癥基因的關(guān)鍵基因顯示了巨大的多樣性,。作者發(fā)現(xiàn)MYC表達升高被證實與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān),。致癌基因ELK4是亞型特異性網(wǎng)絡(luò)中的另一個關(guān)鍵基因：Mesquita等發(fā)現(xiàn)ELK4拷貝數(shù)增加與腫瘤相關(guān)。每個亞型中關(guān)鍵節(jié)點的多樣性從網(wǎng)絡(luò)角度闡明了瘤內(nèi)異質(zhì)性,。

為了研究5個分子亞型中關(guān)鍵基因的功能發(fā)現(xiàn)ETV 6在5個分子亞型特異性GRN中普遍激活,，而不是在正常上皮細胞GRN中激活(圖3B-F)。推測ETV 6可能在5個分子亞型中發(fā)揮重要作用,。然后重點研究了ETV6的功能多樣性發(fā)現(xiàn),，ETV 6在不同亞型中調(diào)控不同的基因。在每個亞型中都有幾個亞型特異性基因,，這可能與乳腺癌的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性有關(guān)(圖4A),。此外，ETV 6在基底樣亞型特異性GRNs中顯示最高,，這可能是基底樣亞型的惡性特征,。接下來，采用GO 富集分析評估了ETV 6在亞型中調(diào)控的基因的功能發(fā)現(xiàn),，ETV 6調(diào)控的基因在不同亞型中發(fā)揮著不同的作用,，顯示出高水平的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(圖4B)?；讟觼喰驮谘馨l(fā)生生物過程中被特異性注釋,，這是由于基底樣亞型中ETV 6對SGPL1的特異性調(diào)節(jié)。Engel等發(fā)現(xiàn)SGPL 1在乳腺癌中的表達可能是預(yù)后標志物,，并作為乳腺癌治療的潛在藥物靶點,。

圖4.關(guān)鍵基因功能的多樣性分析

然后，作者研究了ETV6在不同亞型中的表達水平,。ETV 6在5個分子亞型中Basal-like患者的ETV6的表達量顯著上調(diào),。TCGA基底樣患者和正常乳腺標本中檢測了ETV6的表達,，與正常對照相比，基底樣患者的ETV 6顯著上調(diào)(圖4D),。因此推測ETV 6的激活可能與TNBC患者的生存有關(guān),，而基于代謝數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ETV 6高表達患者的臨床結(jié)局也相對較差(圖4E) 。因此ETV6在5個分子亞型中的激活可能通過調(diào)節(jié)不同基因引起腫瘤內(nèi)異質(zhì)性,，失調(diào)的ETV 6可能成為腫瘤治療的一個潛在靶點,。

在本研究中作者使用scRNA-seq數(shù)據(jù)分析CNV并鑒定出545個惡性細胞,，利用PAM50模型對惡性細胞的亞型進行分類,，配體-受體相互作用分析揭示了巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的重要作用。轉(zhuǎn)錄因子(TF)-基因?qū)脖磉_并富集轉(zhuǎn)錄,，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并鑒定關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn)ETV6在乳腺癌的五種分子亞型中普遍被激活上調(diào),，失調(diào)的ETV6可調(diào)節(jié)各亞型的不同基因。作者使用TNBC患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并從中鑒定到了關(guān)鍵基因,。