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通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP）和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù),，作者從六味地黃丸的六個(gè)TTM成分中獲得了81個(gè)活性成分，它們與614個(gè)靶基因相關(guān),。在進(jìn)行差異表達(dá)分析之前,，作者對(duì)CRC數(shù)據(jù)集進(jìn)行了歸一化，以消除批次效應(yīng),。通過(guò)對(duì)GSE 44076數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析,，作者發(fā)現(xiàn)了1877個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）,。作者用熱圖和火山圖以圖形方式表示作者的數(shù)據(jù)（圖1a，B）,。此外,，作者還采用加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）方法，以GSE 44076數(shù)據(jù)集為基礎(chǔ),，構(gòu)建了一個(gè)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),，以識(shí)別與CRC相關(guān)的關(guān)鍵基因模塊,。根據(jù)尺度獨(dú)立性和平均連通性分析,，作者發(fā)現(xiàn)最佳軟閾值為8（圖1c，d）,。隨后,，構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)基因進(jìn)行了聚類,，并采用動(dòng)態(tài)樹(shù)割方法劃分了基因模塊,。在合并相似模塊后，作者獲得了12個(gè)不同的基因模塊,，聚類樹(shù)狀圖如圖1e所示,。此外，基于基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),，作者繪制了每個(gè)模塊中基因之間相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)熱圖（圖1f）,。然后，對(duì)這12個(gè)構(gòu)件進(jìn)行了構(gòu)件-性狀關(guān)系分析,，結(jié)果表明,，MEblue）顯示出與CRC/非CRC對(duì)照表型的最顯著關(guān)聯(lián)（圖Ig）。進(jìn)一步的分析顯示,，CRC的基因顯著性（GS）與藍(lán)色模塊中的模塊成員資格（MM）之間存在顯著的正相關(guān)性（圖1h）,。總之,，藍(lán)色模塊中的9534個(gè)基因被認(rèn)為是CRC的潛在靶基因,。 LWMX丸在結(jié)直腸癌中的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及蛋白質(zhì)相互作用和藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)計(jì)算DEG、WGCNA中的關(guān)鍵模塊基因和LWMX藥丸中活性成分的靶基因的交集,，作者獲得了108個(gè)基因（圖2a）,。這些交集基因被預(yù)測(cè)為L(zhǎng)WMX藥丸在CRC治療中的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)將這些交集靶基因?qū)氲綑z索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具（STRING）數(shù)據(jù)庫(kù)中,，作者獲得了一個(gè)初級(jí)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2B）,。之后，作者將原始PPI信息輸入Cytoscape 3.9.0進(jìn)行可視化處理（圖2c）,。在由此產(chǎn)生的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)中,，給定靶蛋白的度值越高,，其節(jié)點(diǎn)大小越大，表明該蛋白通過(guò)與其他靶標(biāo)相互作用,，在使用LWMX藥丸的CRC治療中發(fā)揮了更關(guān)鍵的作用,。此外，作者構(gòu)建了LWMX藥丸-CRC網(wǎng)絡(luò),，包括60種活性成分,，108種交集靶基因，6種TTM成分和1種CRC疾病節(jié)點(diǎn)（圖2d）,。具有最高程度值的活性成分,，如槲皮素、（-）-表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯,、木犀草素,、棕櫚油酸和油酸，可能通過(guò)與癌癥相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用干擾CRC的發(fā)展,。功能富集分析與同源靶向通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建作者對(duì)這108個(gè)交集靶基因進(jìn)行了基因本體論（GO）和基因和基因組京都百科全書(shū)（KEGG）途徑富集分析,。GO分析的結(jié)果示于圖3a中。潛在的靶基因主要集中在脂肪酸代謝過(guò)程,、對(duì)脂肪酸的反應(yīng),、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)控、脂質(zhì)分解代謝過(guò)程和對(duì)藥物的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程中,。富集的細(xì)胞組分（CC）入口包括細(xì)胞頂端部分,、胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔,、基底外側(cè)質(zhì)膜和過(guò)氧化物酶體基質(zhì),。富集的分子功能（MF）術(shù)語(yǔ)包括水解酶活性、碳氧裂解酶活性,、碳酸脫水酶活性,、單羧酸結(jié)合和裂解酶活性。此外,，根據(jù)KEGG途徑富集分析,，這些交集靶基因主要富集在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，如PPAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑,、氮代謝途徑,、TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑、與甲狀腺癌相關(guān)的途徑和酒精性肝病途徑（圖3B）,。此外,，基于KEGG分析中的前20個(gè)途徑，作者使用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建了LWMX藥丸治療CRC的成分-靶點(diǎn)-途徑網(wǎng)絡(luò)圖（圖3c）。 為了進(jìn)一步確定使用LWMX藥丸治療CRC的關(guān)鍵樞紐基因,，作者將GSE 44076數(shù)據(jù)集中區(qū)分CRC樣本和非CRC樣本的能力設(shè)置為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),，并使用三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法過(guò)濾了108個(gè)交集靶基因。使用支持向量機(jī)遞歸特征消除（SVM-RFE）算法,，作者鑒定了10個(gè)核心靶基因,，包括LDLR、TUBB 3,、JUN,、CTSG、EPHA 2,、CDKN 1C,、AGT、FOS,、CAT和NQO 2（圖4a,、B）,。作為最小絕對(duì)收縮和選擇算子（LASSO）分析的結(jié)果,，從108個(gè)基因中選擇15個(gè)基因（GCG、AUH,、UBA 2,、TUBB 3、JUN,、CAT,、CFD、AGT,、LDLR,、NQO 2、GSTA 1,、EPHA 2,、FOS、CTSG和CDKN 1C）作為核心靶基因（圖4c,、d）,。根據(jù)用于計(jì)算所有潛在靶基因的變量重要性（VIP）值的隨機(jī)森林（RF）算法，作者獲得了VIP值大于0.5的17個(gè)核心基因（EGR1,、FOS,、HADHB、ACADM,、NR4A2,、JUNB、JUN,、ACLY,、CDKN1C,、PTGS 2、ADORA3,、EPHA 2,、EGLN 1、AKR1C3,、PDE 6A,、TUBB 3和CHRM 3）（圖4e、f）,。通過(guò)計(jì)算這些機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)的核心靶基因的交集,，其中五個(gè)（TUBB3、JUN,、EPHA2,、FOS和CDKN1C）被鑒定為用LWMX藥丸治療CRC的靶樞紐基因（圖4g）。隨后,，作者對(duì)這五種靶中樞基因的不同樣品進(jìn)行基因相關(guān)性（圖4h）和表達(dá)分析（圖4i-m）,。結(jié)果表明，它們之間存在密切的相關(guān)性,，并且它們?cè)诮Y(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于非結(jié)直腸癌組織,。 首先，作者使用通過(guò)估計(jì)RNA轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)子集的細(xì)胞類型鑒定（CIBERSORT）工具來(lái)可視化GSE 44076數(shù)據(jù)集中每個(gè)樣品內(nèi)22個(gè)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖5a）,。然后,，作者分析了CRC組織和非CRC對(duì)照中不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的區(qū)別（圖5B）。結(jié)果表明,，在結(jié)直腸癌樣本中,，M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞的比例在結(jié)直腸癌樣本中顯著較高,，而漿細(xì)胞,、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞,、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞,、靜息肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的比例在結(jié)直腸癌組織中顯著較低。此外,，作者分析了五種靶樞紐基因的表達(dá)水平與各種類型免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性（圖5c）,。結(jié)果顯示，嗜酸性粒細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞的相對(duì)豐度與所有樞紐基因的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān);另一方面,，活化肥大細(xì)胞的比例與所有5個(gè)樞紐基因的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān),。 進(jìn)行分子對(duì)接分析以驗(yàn)證LWMX藥丸的活性成分與靶樞紐基因之間的結(jié)合潛力。制備來(lái)自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）的五個(gè)靶樞紐基因的相應(yīng)結(jié)構(gòu)文件作為蛋白質(zhì)受體，包括TUBB 3（PDB ID：6S 8L）,、JUN（PDB ID：6 Y3 V）,、EPHA 2（PDB ID：1 MQB）、FOS（PDB ID：1A 02）和CDKN 1C（PDB ID：4G 5 Y）,。選擇具有最高度值的四種活性成分作為藥物配體：槲皮素,、（-）-表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯、木犀草素和棕櫚油酸,。目標(biāo)-成分結(jié)合能的熱圖如圖6a所示,。人們普遍認(rèn)為，受體蛋白和配體化合物之間的結(jié)合能低于?5 kcal/mol表示確證的結(jié)合親和力[18],。作者的研究結(jié)果表明,，所有四種活性成分都具有與靶基因的顯著結(jié)合潛力。此外,，圖6b-e中顯示了幾種典型的具有強(qiáng)結(jié)合活性的靶標(biāo)-成分結(jié)合相互作用,。 總結(jié) 作者確定了LWMX藥丸在CRC治療中的重要活性成分和潛在靶點(diǎn)。LWMX藥丸-CRC相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能富集分析的結(jié)果表明,，使用LWMX藥丸的多靶點(diǎn)CRC治療涉及多種生物學(xué)過(guò)程,，如炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。作者使用機(jī)器學(xué)習(xí)工具確定了五個(gè)目標(biāo)樞紐基因（TUBB 3,，JUN,，EPHA 2,，F(xiàn)OS和CDKN 1C）,。免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果表明，LWMX丸可以通過(guò)調(diào)節(jié)靶樞紐基因的表達(dá)水平來(lái)影響CRC中的免疫微環(huán)境,。分子對(duì)接結(jié)果顯示,，所有目標(biāo)樞紐蛋白和LWMX藥丸的主要活性成分，如槲皮素,，（-）-表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯,，毛地黃黃酮和棕櫚油酸之間有希望的結(jié)合親和力。作者的研究結(jié)果說(shuō)明了LWMX藥丸在分子和途徑水平上的抗CRC潛力和機(jī)制,，并為CRC治療的多靶點(diǎn)藥物提供了新的見(jiàn)解,。
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