今天我們一起來了解一下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相關(guān)的一些技術(shù)背景和方法,，隨著基因與蛋白功能研究的深入,，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室研究工作中經(jīng)常涉及的基本方法。

DNA轉(zhuǎn)染干貨篇?。,。≠|(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的比較

一,、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原理以及應用

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是指利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒DNA通過直接穿膜或膜融合的方法將外源DNA分子導入真核細胞,，使外源基因表達，從而針對某個基因和蛋白質(zhì)的功能進行一系列生物學功能研究的方法,。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷深入,，DNA轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)實驗工具。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在研究基因功能,、調(diào)控基因表達,、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生命科學前沿研究中，應用越來越廣泛,。

二,、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法

質(zhì)粒DNA導入細胞有多種方法，包括物理介導（電穿孔法,、顯微注射和基因槍）,、化學介導（磷酸鈣共沉淀法、載體轉(zhuǎn)染法等）和生物介導（原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,、病毒介導的轉(zhuǎn)染）三類途徑。這三類技術(shù)中,，又以載體轉(zhuǎn)染法最為常用,。國際上應用較早的轉(zhuǎn)染載體多為脂質(zhì)體類載體,，但此類轉(zhuǎn)染載體細胞毒性較大，轉(zhuǎn)染效率往往也不夠理想,。近年類,，納米生物材料類載體的應用逐漸增多，此類載體最大的優(yōu)點是細胞毒性較低,，部分品牌載體的轉(zhuǎn)染效率也顯著優(yōu)于脂質(zhì)體類載體,。

三、如何選擇DNA轉(zhuǎn)染試劑

顯然,，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能否成功的關(guān)鍵在于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的選擇,，目前常用的DNA轉(zhuǎn)染試劑有RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑、Lipo2000等,。如何選擇合適的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑,，一般可從以下幾個方面考慮：

1.對質(zhì)粒DNA有較高的轉(zhuǎn)染效率。

轉(zhuǎn)染效率的確定,，常用的是使用熒光定量PCR,、熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測等方法。金標準無疑是檢測目標基因的mRNA水平,，因為轉(zhuǎn)染試劑不僅要把質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進入細胞,，還應及時把轉(zhuǎn)入細胞的DNA釋放出來，發(fā)揮基因表達或基因調(diào)控的作用,。通過熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率至少存在兩方面的問題：1,、熒光顯微鏡看到的熒光點可能是非特異吸附的結(jié)果；2,、有些轉(zhuǎn)染試劑能夠?qū)①|(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入細胞,，但不能充分釋放，導致基因表達或基因調(diào)控效率并不高,。因而,，判斷轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率的金標準應該是熒光定量檢測mRNA水平，僅靠觀察熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率,、選擇轉(zhuǎn)染試劑往往會導致誤判,，影響實驗的進展。

目前國內(nèi)應用最廣的轉(zhuǎn)染試劑有RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑,、Lipo2000等,。其中，Lipo2000為脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑,，國際知名品牌,，RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑為生物納米材料類轉(zhuǎn)染試劑，是近幾年應用較廣的轉(zhuǎn)染試劑,。RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑雖在國內(nèi)生產(chǎn),，但實際上也是在美國研發(fā)成功,。就轉(zhuǎn)染效率而言，RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑對絕大多數(shù)貼壁細胞的轉(zhuǎn)染效率可高達90%以上（EGFP質(zhì)粒）,，另外,，RFect^SP懸浮細胞質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑專門針對懸浮細胞的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率在大部分懸浮細胞中高達70%以上,。與之相比,，Lipo2000對大多數(shù)貼壁細胞的轉(zhuǎn)染效率一般為75%左右，對有些原代細胞以及懸浮細胞根本無法做到有效轉(zhuǎn)染,。顯然,，從轉(zhuǎn)染效率上說，RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑更具優(yōu)勢,。

2. 對轉(zhuǎn)染細胞的毒性很小,。

轉(zhuǎn)染試劑如果毒性過大，會導致大量細胞死亡,，這會直接影響對轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果的判讀和解析,。脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑本身會導致某些基因的表達改變，因而會影響轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果的客觀性,。以上可見,，應盡量選擇毒性較小的轉(zhuǎn)染試劑。

有些研究者對細胞毒性不太重視,，僅僅考慮是否可將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進入細胞,，其結(jié)果在某些高水平的期刊，往往會導致審評的質(zhì)疑,。對于國內(nèi)常見的幾種轉(zhuǎn)染試劑來說,，RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑主要由生物納米材料制成，細胞毒性較低,，轉(zhuǎn)染細胞死亡率不到10%,。Lipo2000屬于脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑，具有脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染載體固有的細胞毒性,，細胞毒性往往較高,，轉(zhuǎn)染細胞死亡率有時在30%以上。

3. 轉(zhuǎn)染細胞的種類,。

目前常見的轉(zhuǎn)染試劑包括RFect,、Lipo2000及國內(nèi)其它廠家的產(chǎn)品，主要轉(zhuǎn)染對象為貼壁培養(yǎng)細胞,，對懸浮細胞和原代細胞的轉(zhuǎn)染效率都不是非常理想,。Lipo2000對原代和懸浮細胞基本上無法做到有效轉(zhuǎn)染，而且因為原代細胞較馴化的細胞株敏感性更高，Lipo2000轉(zhuǎn)染后的死亡率也很高,。RFect系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑細胞毒性較低,，根據(jù)轉(zhuǎn)染的細胞種類不同,，可以選購RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑或者RFect^SP懸浮細胞質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑,。

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