目前的下一代基因測序（NGS）市場,，Illumina繼續(xù)獨占鰲頭。自從推出HiSeq X測序平臺以來,，大幅度降低了基因測序的成本,，即使是研究級全基因組測序的成本一直穩(wěn)定在1000美元左右。至此以后，這一水平的唯一競爭對手——華大基因的Revolocity測序儀也顯得吃力,。這也引起了許多研究人員猜測,，長此以往會導(dǎo)致這一領(lǐng)域缺乏競爭力，導(dǎo)致NGS的發(fā)展（至少在短鏈閱讀研究上）十分緩慢,。但令人欣慰的是,，NGS在其他領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展也十分迅速。

近日,，Genetic Engineering & Biotechnology News對這些領(lǐng)域做了一次盤點,，動脈網(wǎng)（微信：vcbeat）對主要內(nèi)容進(jìn)行了編譯。

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長鏈閱讀技術(shù)

NGS在長鏈閱讀領(lǐng)域有巨大的進(jìn)展,，揭示了基因組合轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜性,。在基因組的分析過程中，主要的問題是處理重復(fù)序列的DNA,。如果序列重復(fù)的長度要長于基本閱讀的長度,，那么實現(xiàn)參考基因組的唯一映射就會變得很困難，甚至是不可能,。

無獨有偶,，基因轉(zhuǎn)錄的分析過程也面臨同樣的挑戰(zhàn)?！按蠖鄶?shù)基因包含了多個外顯子,，以至于mRNA的長度比閱讀范圍的長度要長?！盤ersonalized Healthcare 的Brenton Gravely博士表示：“因此,，利用長鏈閱讀來準(zhǔn)確無誤的了解特定樣品中存在哪一種異構(gòu)體，是不太可能的,?！?/span>

 Oxford Nanopore是一家備受關(guān)注基因測序公司。去年春天,，Oxford Nanopore率先推出了基于納米孔技術(shù)的測序儀MinION,。盡管 后來Oxford Nanopore推遲了正式發(fā)布的時間，但公司已經(jīng)確實將它的技術(shù)推廣到大眾,。目前,，超過1000家研究團(tuán)隊使用是MinION測序儀。

在最初版本發(fā)布一年之內(nèi),，通過對酶化學(xué)和納米孔設(shè)計的一系列改進(jìn),，MinION的生產(chǎn)量從不足1億增長至超過10億。從質(zhì)量,，產(chǎn)量和成本來看,，MinION與Illumina還存在一定差距，但 Oxford Nanopore 的儀器卻在兩方面占有優(yōu)勢：閱讀長度和可移動性。

在使用者的報告中反饋出,，成千數(shù)萬次閱讀中的平均長度超過了10萬,。DNA的輸入質(zhì)量和預(yù)備存儲似乎是限制閱讀長度的唯一真正的因素。也就是說,，如果滿足了輸入質(zhì)量和預(yù)備存儲,，就能夠延長閱讀長度。

同時,，MinION還是一款可手持的測序儀,，甚至可以在野外完成數(shù)據(jù)收集，不需要將處理后的樣品帶回實驗室再進(jìn)行分析,。一開始,，數(shù)據(jù)質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Illumina，但經(jīng)過改進(jìn),，數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)大幅提高,。最新的R9 主打快捷模式，在理想環(huán)境下,，測試的精度已經(jīng)上升到95%,。

太平洋生物是長鏈閱讀測序的領(lǐng)導(dǎo)者，近年也是成果頗豐,。去年美國人類遺傳學(xué)會上,，公司公布了一個新的平臺---Sequel。這個平臺是與羅氏合作開發(fā)的成果,，相比之前的RS II,，在各個方面都有提升。

與RS II相比,，Sequel的輸出率更大,，所占空間不到之前2/3，成本也只需要之前的一半,。一直以來,，太平洋生物科學(xué)公司都希望平臺能夠充分利用，解決化學(xué)和供應(yīng)問題,，特別是對可消費的SMRT（single molecule, real time）細(xì)胞,。目前，這兩個問題似乎都得以解決,，公司正在等待第一批客戶生成的數(shù)據(jù)反饋,。

除了以上兩家，行業(yè)內(nèi)有影響力的還有GemCode的10X Genomics,，可以從底層短鏈閱讀數(shù)據(jù)生成連接,。盡管這項技術(shù)還存在一些瑕疵，比如對于長于底層短鏈閱讀的重復(fù)片段作用不大,。但目前平臺運作良好,，今年早些時候還與Illumina 簽訂了聯(lián)合營銷協(xié)議，如果 Illumina的Moleculo synthetic長鏈閱讀技術(shù)衰退,，則協(xié)議開始生效,。

盡管有所進(jìn)步，但長鏈閱讀技術(shù),，特別是基因轉(zhuǎn)錄測序,，仍有問題仍急需解決?！岸渲幸粋€問題就是目前這些平臺的吞吐量,，但更大的問題是，逆轉(zhuǎn)錄酶的間斷性還不夠,?！盙ravely博士解釋道：“在RNA直接測序中，性能優(yōu)越的逆轉(zhuǎn)錄酶可以帶來很大的改變,?！?/span>

令轉(zhuǎn)錄研究人員興奮的是，Oxford Nanopore在最近發(fā)表的一篇論文中表明,，他們正著手推出利用MinION 直接測序RNA的商業(yè)試劑盒,。

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單細(xì)胞基因組學(xué)

另一個應(yīng)用就是單細(xì)胞基因組學(xué)。到目前為止,，所有NGS項目（只有極少數(shù)例外）都是在混合細(xì)胞中進(jìn)行的,，即從上千乃至上萬個細(xì)胞中對單個細(xì)胞進(jìn)行測序。如果所有的細(xì)胞都是完全均勻的,，那么所有細(xì)胞可作為一般情況下的體細(xì)胞基因組,，這并不是一個問題。然而,，許多應(yīng)用程序中,，并不是所有的細(xì)胞都是完全均勻的，需要集中匯集挑選關(guān)鍵信息,。

例如,，腫瘤活檢就極富異質(zhì)性，包含了體細(xì)胞和癌細(xì)胞,。不僅如此,，即使是同一個腫瘤的癌細(xì)胞也可能有不同的基因組。匯聚多個細(xì)胞,，就會產(chǎn)生一個混合的基因組庫,，加大了解釋和分析的難度,。目前的研究水平，只有小部分的細(xì)胞變化是可以忽略不計的,。

一開始,，研究人員采取的策略是嘗試在活檢組織內(nèi)部的幾個不同的地方，分別采取幾個單細(xì)胞進(jìn)行測量,。如果積累了足夠多的個體測量,，那么就可以建立一個全面的腫瘤基因組視圖。

另一個方法就是單細(xì)胞途徑,。轉(zhuǎn)錄組是高度可變的細(xì)胞,，將細(xì)胞聚集起來可以掩蓋基因表達(dá)模式的潛在變異。

“就在幾年前,，上百個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄學(xué)分析可能花費大量的時間和資源,。”基因組學(xué)科學(xué)家Richard Shen最近離開了Illumina跳槽到RS技術(shù)公司,，他提到：“現(xiàn)在,，隨著簡單易用的NGS文庫技術(shù)的發(fā)展，大大降低了開發(fā)成本,，分析上千個單細(xì)胞不僅成為現(xiàn)實,，而且所分析得到的數(shù)據(jù)在許多應(yīng)用中也顯示了價值?！?/span>

對于單細(xì)胞庫的制備,，許多平臺都可以實現(xiàn)：Fluidigm的C1，可以同時處理800個細(xì)胞,；Chromium的10X Genomics,，更是可同時處理多達(dá)48000個細(xì)胞。這樣的處理能力,，并不是每個研究人員的目的,，Gravely 指出：“一些平臺或者自制設(shè)備的吞吐量是非常讓人興奮的，我們所希望看到的是疊加效果,，比如像holy grai這樣的單細(xì)胞長鏈閱讀測序儀,。”

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癌癥液體活檢

同樣吸引人注意應(yīng)用就是癌癥診斷的液體活檢,。某種程度上,，NGS在腫瘤活檢領(lǐng)域的應(yīng)用在正越來越普及。Foundation醫(yī)學(xué)的FoundationOne測試就是最好的例子,。一個由315種相關(guān)癌癥基因的標(biāo)記組合成的單一測試面板,。這些基本面板測試取代了傳統(tǒng)的單一基因測試。

癌癥診斷也在從腫瘤組織活檢向液體活檢偏移,。不同于從腫瘤上切片提取DNA,，癌癥液體活檢從循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）或者患者血液中游離細(xì)胞中提取游離DNA（cfDNA）,。就目前來看，由于提供了許多解刨和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的信息,，腫瘤組織活檢暫時不會消失,，但是許多液體活檢的研究人員表示，液體活檢具有更多功能性,。

“從癌癥篩查的角度來看，液體活檢更具有吸引力,，因為他們不但更簡單準(zhǔn)確,，而且可以進(jìn)行癌癥之前的常規(guī)檢查?！盕reenome聯(lián)合創(chuàng)始人兼首席執(zhí)行官 Gabriel Otte表示：“從預(yù)防和確診病人的檢測來看,，液體活檢同樣具有優(yōu)勢，尤其是那些超過30%因為各種原因不適合侵入性活檢的病例,?！?/span>

作為一個熱門的新領(lǐng)域，一些新興企業(yè)正迅速成長,，更多的大公司正在革新以占取龐大且不斷增長的市場,。

早在2014年，Guardant Health聲稱他們是第一個走向市場的液體活檢企業(yè),。這一診斷被稱為Guardant360,。Freenome采取了不同的手段，通過測試癌癥全基因組來實現(xiàn)癌癥診斷,?！拔覀円揽课覀兊纳疃葘W(xué)習(xí)?！監(jiān)tte表示：“為了做出準(zhǔn)確的癌癥檢測,，我們根據(jù)最相關(guān)的特定區(qū)域?qū)ψ龀隽颂囟ǖ姆謪^(qū)?！?/span>

Illumina的測序技術(shù)已經(jīng)被大多數(shù)公司利用,，在這場競技中，也推出自己的液體活檢公司---Grail,。也許是為了避免與自己的客戶出現(xiàn)直接競爭,，Illumina表示將主要圍繞前期篩選，這個沒有其他公司關(guān)注,，且更具挑戰(zhàn)性的任務(wù),。

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縱向研究

隨著液體活檢的出現(xiàn)，監(jiān)測研究性試驗中腫瘤患者的反映,，以及適當(dāng)?shù)臉悠犯櫼呀?jīng)變得越來越重要,。這一過程,，至少需要分析3種樣品：腫瘤組織，正常組織和循環(huán)游離DNA,。

當(dāng)測序在的目標(biāo)較大,，比如對全基因組進(jìn)行排序時，遺傳指紋是可以被確定的,，以至于在數(shù)據(jù)分析過程中樣本可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠ヅ?。然而，Swift Biosciences生物學(xué)家Drew McUsic博士表示,，當(dāng)測序目標(biāo)較小時,，遺傳指紋不能產(chǎn)生。

“直到現(xiàn)在,，研究人員仍利用單核苷酸的多樣性與LIMS系統(tǒng)排列配對來正確跟蹤樣本,。”McUsic博士指出：“這些方法依賴于對多個樣本的正確標(biāo)記,，以及數(shù)據(jù)文件與材料的精確匹配,。”

為了尋找更精確的樣本識別方法,，Swift生物科技開發(fā)了一款A(yù)ccel-Amplicon? Sample_ID 面板,。遺傳指紋由104個外顯子和性別特異性擴(kuò)增子提供，作為低比例spike-in（待測樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)樣,，以檢測你在實驗操作過程中的樣品損失）,，添加到任意一個Swift增擴(kuò)平臺，例如 Accel-Amplicon 56G Oncology Panel v2,。McUsic博士還補充到：“從淺顯的生殖測序到到深度覆蓋性體細(xì)胞突變檢測都可以使用這樣的技術(shù),。”

該技術(shù)不僅提供了一個有效的,，單管檢測分析腫瘤標(biāo)本的體細(xì)胞突變,，同時在相同的測序文件內(nèi)產(chǎn)生基因指紋。他繼續(xù)說道,，隨著越來越多的項目被設(shè)計應(yīng)用到跟蹤腫瘤患者的反應(yīng)率,，在這些縱向研究將選擇合適的標(biāo)本跟蹤工具將顯得越來越重要。

目前來看,，Illumina將繼續(xù)占有市場主導(dǎo)地位以及短鏈閱讀的高通量,，但其他公司也在其他領(lǐng)域?qū)で筮M(jìn)步。Oxford Nanopore宣布了許多即將展開的研究,，包括高通量的納米孔測序儀PromethION,。該公司聲稱，他的吞吐量將能夠與Illumina的 HiSeq X競爭,。公司還就 兩臺自動化樣品儀器VolTRAX和 Zumbador展開討論,，保證未來DNA測序的全方位簡化,。

太平洋生物的 Sequel 平臺也有望被迅速采用。它可能帶來測序成本的降低,，升值可能趕超Illumina,。可以肯定的是,，隨著使用的簡化和成本的減少,，NGS臨床使用的障礙將得到改善。

文|周夢亞

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