大腦中有上千億個(gè)神經(jīng)細(xì)胞,，又叫神經(jīng)元，它們之間通過(guò)百萬(wàn)億個(gè)突觸聯(lián)結(jié)形成復(fù)雜有序的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與環(huán)路,。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中高度有序的神經(jīng)活動(dòng)則構(gòu)成了認(rèn)知,、思維、意識(shí)和語(yǔ)言等高級(jí)腦功能的基礎(chǔ),。就像通訊系統(tǒng)中，信息的收發(fā)和存儲(chǔ)依賴于通訊網(wǎng)絡(luò)的基站,，神經(jīng)信息的傳遞與存儲(chǔ)的最基本結(jié)構(gòu)與功能單元?jiǎng)t是神經(jīng)突觸,。
突觸功能的發(fā)揮則依賴于突觸中大量蛋白分子的協(xié)調(diào)工作，其中一種特殊的蛋白分子叫受體分子,，也就是信息的接收器,。當(dāng)信息傳遞到突觸時(shí)，突觸前神經(jīng)元就會(huì)釋放信號(hào)分子（神經(jīng)遞質(zhì)）到突觸間隙,，突觸后神經(jīng)元上的受體就會(huì)接受信號(hào)分子,，使下一級(jí)神經(jīng)元產(chǎn)生興奮或抑制。這些受體蛋白在突觸中的功能結(jié)構(gòu)狀態(tài)以及它們?cè)谕挥|中的數(shù)量和排列方式直接影響著大腦信息傳遞的效能,。突觸又能夠根據(jù)神經(jīng)活動(dòng)的強(qiáng)弱而改變自身傳遞效能,，亦即突觸可塑性，在這一過(guò)程中,，突觸中的蛋白分子數(shù)量和分布會(huì)發(fā)生變化,，而記憶很可能恰恰就存儲(chǔ)于突觸中受體蛋白的組織和分布變化中。
精確解析突觸的蛋白分子結(jié)構(gòu)和組織架構(gòu),、及其在神經(jīng)活動(dòng)或異常過(guò)程中的變化無(wú)疑是解密大腦奧妙的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),，也是腦科學(xué)與腦疾病研究中最基礎(chǔ)的核心研究方向之一。對(duì)大腦中各類受體蛋白為主的分子機(jī)器的作用機(jī)理進(jìn)行解密,，通俗講既是破譯大腦的分子密碼,。
“眼見(jiàn)為實(shí)”，借助成像手段直接透視生命體系中的物質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)和內(nèi)在規(guī)律,，一直是生命科學(xué)研究的不二之法,。神經(jīng)突觸的大小在幾百納米的尺度（大概是頭發(fā)絲直徑的百分之一）。突觸中的分子就更小了,，通常在幾個(gè)納米左右,。在這個(gè)尺度下，只有光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡能夠具備這種成像條件,。光學(xué)顯微鏡由于光波長(zhǎng)（200-600納米）的限制,，仍舊沒(méi)有辦法觀測(cè)到突觸中的納米尺度的分子。電子顯微鏡所采用的電子波長(zhǎng)經(jīng)過(guò)加速后可達(dá)0.002納米，能夠觀察到高分辨的分子乃至原子信息,。更進(jìn)一步,，冷凍電鏡技術(shù)使得我們可以直接觀察被快速冷凍固定（零下180°左右）在近生理狀態(tài)下的樣品。
冷凍電鏡（CryoEM）技術(shù)的快速發(fā)展,，一方面使得眾多通過(guò)分離純化后的蛋白質(zhì)等生物大分子近原子分辨三維結(jié)構(gòu)得以解析,，正因?yàn)槿绱?017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給三位冷凍電鏡技術(shù)的開(kāi)拓者。另一方面,，基于最新的冷凍電鏡斷層三維成像技術(shù)（CryoET）能夠?qū)Ρ４嬖诮頎顟B(tài)下細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行納米分辨率的三維成像,，為在神經(jīng)突觸及其它細(xì)胞區(qū)室中原位解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和組織架構(gòu)帶來(lái)了新的契機(jī)。
近日,，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)與中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院雙聘教授畢國(guó)強(qiáng)和劉北明團(tuán)隊(duì),，與美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校周正洪教授合作，通過(guò)發(fā)展前沿冷凍電鏡細(xì)胞原位成像技術(shù),，首次解析了抑制性突觸中GABAA受體的原位三維結(jié)構(gòu),，并首次闡釋了抑制性突觸中受體蛋白和骨架蛋白層級(jí)化的組織規(guī)則。研究成果以 Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses為題發(fā)表在Nature Neuroscience上(DOI: 10.1038/s41593-020-00729-w).
在前期的工作中,，研究人員將大鼠胎鼠的海馬體神經(jīng)細(xì)胞解離并直接培養(yǎng)在冷凍電鏡的樣品載網(wǎng)上（類似于光學(xué)顯微鏡成像使用的載玻片）,，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后神經(jīng)細(xì)胞之間能夠形成突觸連接，進(jìn)而形成微型的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),。這種樣品可以直接通過(guò)投入式快速冷凍固定,，既是將電鏡載網(wǎng)直接投入到液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，這樣在幾十毫秒內(nèi),，神經(jīng)細(xì)胞被冷凍固定到-180°以下,，樣品內(nèi)部近生理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)得以保存，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的瞬間“定格”,。這種樣品可以直接傳輸?shù)嚼鋬鲭婄R中進(jìn)行冷凍電鏡斷層三維成像（將樣品進(jìn)行傾轉(zhuǎn),，同時(shí)收集不同角度的二維投影），經(jīng)過(guò)后期三維重構(gòu)處理,，即可重現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)分子水平的三維結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的“回放”。
利用這種手段并結(jié)合自主研發(fā)的新型冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像技術(shù),，研究人員開(kāi)創(chuàng)性地對(duì)神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究,，解析了首個(gè)完整神經(jīng)突觸的高精度三維結(jié)構(gòu)，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中兩類最主要突觸-興奮性與抑制性突觸的精確區(qū)分以及結(jié)構(gòu)特征的定量化分析(Tao, Liu et al. 2018a; Tao, Liu et al. 2018b; Liu, Tao et al. 2019; Sun, Liu et al. 2019),。
圖1. 冷凍電鏡斷層原位成像技術(shù)解析神經(jīng)突觸受體蛋白原位結(jié)構(gòu)與組織分布
在此基礎(chǔ)上,，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)展了一種基于過(guò)采樣與自動(dòng)分類的冷凍電鏡斷層三維成像亞區(qū)域圖像處理方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞斷層三維重構(gòu)圖像中無(wú)標(biāo)記和無(wú)模板依賴的蛋白質(zhì)自動(dòng)識(shí)別和三維重構(gòu)分析,?；谶@一方法,，研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)抑制性突觸中GABAA受體的自動(dòng)化識(shí)別并解析了其19?分辨率的原位三維結(jié)構(gòu)，這是目前已報(bào)道的首個(gè)突觸原位受體蛋白結(jié)構(gòu),。
進(jìn)一步,，通過(guò)對(duì)GABAA受體在突觸中的空間分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些受體在抑制性突觸中呈現(xiàn)層級(jí)狀的組織分布特性：GABAA受體之間可以形成具有距離固定（11nm間距）而相對(duì)角度可變的雙分子復(fù)合物,；這種雙分子復(fù)合物進(jìn)一步組成具有較低熵并且具備自組織特性的二維網(wǎng)絡(luò),；最后形成具有清晰邊界并介于固、液之間的“介態(tài)”相分離狀態(tài)（mesophasic organization）,。這些組織形式可以通過(guò)突觸后支架蛋白和受體之間靈活的相互作用而形成,，并且與突觸前囊泡釋放位點(diǎn)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。
圖2. 抑制性突觸中受體等蛋白分子與細(xì)胞器組織分布的三維可視化
(圖片版權(quán)：陶長(zhǎng)路,、劉云濤,、畢國(guó)強(qiáng)；圖片制作：王國(guó)燕,、馬燕兵)
抑制性突觸中受體蛋白的這種半穩(wěn)定的組織架構(gòu)很好地體現(xiàn)了神經(jīng)突觸既能保持信息傳遞穩(wěn)定性又具備可塑性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從分子組織結(jié)構(gòu)層面很好地解釋了學(xué)習(xí)與記憶的結(jié)構(gòu)機(jī)理,。通過(guò)應(yīng)用與發(fā)展前沿細(xì)胞原位冷凍電鏡斷層成像技術(shù)這種全新的嘗試,，實(shí)現(xiàn)了對(duì)突觸生理狀態(tài)下分子水平結(jié)構(gòu)與功能探究的突破，為破解大腦的分子密碼邁出了關(guān)鍵的一步,。
參考文獻(xiàn)：
1. Tao, C. L., et al. (2018). "Differentiation and Characterization of Excitatory and Inhibitory Synapses by Cryo-electron Tomography and Correlative Microscopy." JNeurosci 38(6): 1493-1510.
2. Tao, C. L., et al. (2018). "Accumulation of Dense Core Vesicles in Hippocampal Synapses Following Chronic Inactivity." Front Neuroanat 12: 48.
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4. Sun, R., et al. (2019). "An efficient protocol of cryo-correlative light and electron microscopy for the study of neuronal synapses." Biophysics Reports 5(3): 111-122.
作者：劉云濤,、陶長(zhǎng)路、畢國(guó)強(qiáng)
來(lái)源：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
