王曉東院士課題組最新發(fā)現(xiàn),，外泌體釋放和溶酶體降解兩種途徑為通過抑制MLKL功能來治療阿爾茨海默病提供了進一步的依據(jù)。

壞死性凋亡“劊子手”的退出

在壞死性凋亡的細胞中,，假激酶MLKL被磷酸化從而能夠破壞質(zhì)膜,。 然而，磷酸化MLKL的出現(xiàn)并不總是導致壞死性凋亡,，這促使王曉東課題組研究這種壞死性凋亡“劊子手”的活性是如何被抑制的,。他們發(fā)現(xiàn)磷酸化的MLKL可能被flotillin-1和flotillin-2導入脂筏，隨后進入溶酶體,。此外,，磷酸化的MLKL可通過依賴于ESCRT蛋白ALIX和syntenin-1的外泌體從細胞中釋放出去。 這些機制可能是確保只有足夠強度的信號才能誘導壞死性凋亡的保障措施,。

摘要

壞死性凋亡是一種受調(diào)節(jié)的壞死，與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的各種人類疾病有關(guān),。壞死性凋亡需要假激酶MLKL在被激酶RIPK3磷酸化后從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜,。使用蛋白質(zhì)交聯(lián)，然后進行親和純化,，研究人員在膜定位的MLKL免疫沉淀物中檢測到脂筏相關(guān)蛋白flotillin-1和flotillin-2以及ESCRT相關(guān)蛋白ALIX和syntenin-1,。通過flotillin介導的內(nèi)吞作用隨后溶酶體降解或ALIX-syntenin-1介導的胞吐作用從膜中除去磷酸化的MLKL。因此,，在發(fā)生質(zhì)膜破壞之前,，經(jīng)歷壞死性凋亡的細胞需要克服這些獨立的抑制機制。

響應于腫瘤壞死因子受體（TNFR）的激活,，哺乳動物細胞可以激活多種信號傳導途徑,，包括通過細胞凋亡或壞死導致細胞死亡的途徑。如果凋亡拮抗劑Smac（也稱為Diablo）的細胞抑制劑豐度高并且引起細胞凋亡的胱天蛋白酶-8的活性相對較低,，則發(fā)生一種這樣的壞死性細胞死亡——壞死性凋亡（necroptosis）,。因此，通過組合TNFα,、一種模擬Smac蛋白功能的小分子和泛半胱天冬酶抑制劑可以強有力地誘導壞死性凋亡,。這種處理激活受體相互作用蛋白激酶RIPK1，然后RIPK1通過它們各自的RIP同型相互作用基序區(qū)域的相互作用募集相關(guān)激酶RIPK3,，導致RIPK3活化,。Ser227位點磷酸化而激活的RIPK3募集并磷酸化其底物——混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL），這是一種假激酶,，通常將其假激酶結(jié)構(gòu)域折疊成一種構(gòu)象,。RIPK3介導的位于其假激酶結(jié)構(gòu)域的Thr357和Ser358處的MLKL的磷酸化減輕了假激酶結(jié)構(gòu)域的抑制作用，從而允許活化的磷酸化MLKL寡聚化并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜（包括質(zhì)膜）以引起膜崩解導致壞死,。

在壞死性凋亡研究中存在的一個主要問題是,，一旦磷酸化MLKL到達質(zhì)膜，壞死細胞死亡是如何被執(zhí)行和調(diào)節(jié)的。具有磷酸化模擬突變或缺乏抑制性C-末端假激酶結(jié)構(gòu)域的純化MLKL變體可以在體外有效地破壞含有帶負電荷的磷脂的人造脂質(zhì)體膜,。因此,，MLKL的N-末端螺旋束似乎具有內(nèi)在的膜破壞活性。然而,，與先前的報道一致,，在壞死性凋亡誘導后觀察到磷酸化MLKL，并且如果及時去除壞死性凋亡劑,，細胞可以恢復,。因此，在膜破裂發(fā)生之前,，活性MLKL必須克服負調(diào)節(jié)劑,。先前已有各種研究表明，ESCRT途徑可以從經(jīng)歷壞死性凋亡的細胞中去除含磷酸化MLKL的膜囊泡,，從而減弱這種細胞死亡過程,。目前的研究表明，對抗磷酸化MLKL的壞死作用,，它不是一個而是兩個這樣的調(diào)節(jié)途徑,。除了由MLKL相互作用的ALIX和syntenin-1介導的ESCRT介導的外泌體胞吐作用外，flotillin介導的胞吞作用隨后溶酶體降解是另一種從質(zhì)膜中去除磷酸化MLKL的主要途徑,。

研究人員相信磷酸-MLKL和flotillins以及上述ESCRT相關(guān)蛋白之間的相互作用不是由于在特定的膜結(jié)構(gòu)（例如脂筏）上的共定位,，而是由于特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。敲除flotillins與磷酸化MLKL的脂筏定位的喪失有關(guān),。此外,，在flotillin-1的Leu380位點周圍多個單個氨基酸殘基變化導致磷酸-MLKL與flotillins的結(jié)合喪失和從壞死細胞中去除磷酸-MLKL的能力。此外,，即使通過NSA處理阻止MLKL到達質(zhì)膜時,，ALIX和syntenin-1仍然與磷酸-MLKL共免疫沉淀（而flotillins沒有）。然而,，盡管數(shù)據(jù)提示了flotillins和磷酸化MLKL之間的直接相互作用,，但作者承認，正式證據(jù)不包括在本研究中,，可以通過使用這些蛋白質(zhì)的純化片段的體外結(jié)合測定來解決,。

MLKL與這些上述蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)都需要完整的MLKL的N-末端螺旋束。這種關(guān)聯(lián)可以有效地干擾MLKL的膜破壞活性,，并通過從膜上除去磷酸-MLKL來防止壞死性凋亡,。鑒于壞死細胞死亡的后果，細胞已經(jīng)進化出有效和冗余的監(jiān)測系統(tǒng)以確保接收的任何死亡信號是真實信號并不罕見,。此外,，不同的細胞類型應該能夠通過其多個監(jiān)測系統(tǒng)設(shè)定其游離磷酸化MLKL的假陰性“耐受水平”,。

因此，作者提出以下的壞死性凋亡模型：游離磷酸化MLKL積累到足夠的水平,，導致直接的膜破壞,。要做到這一點，磷酸化MLKL必須首先克服這些先天的防御線,，然后才能破壞質(zhì)膜以驅(qū)動壞死性凋亡,。該假設(shè)不排除MLKL與壞死性凋亡執(zhí)行的結(jié)合配體的存在。通過消除由該研究鑒定的磷酸-MLKL相互作用蛋白可以促進尋找這些潛在的蛋白,。

該研究觀察到阿爾茨海默病患者錐體神經(jīng)元細胞內(nèi)囊泡中磷酸化MLKL與flotillins的共定位,，以及阿爾茨海默病中壞死性凋亡的作用，可以說明這種防御機制如何在患病組織中起作用,。最終可以通過這些機制來克服不必要的壞死性凋亡,。

參考文獻：

Weiliang Fan, Jia Guo, Beichen Gao, Wenbin Zhang, LiucongLing, Tao Xu, Chenjie Pan, Lin Li, She Chen, Hua Wang, Jing Zhang, and Xiaodong Wang*. Flotillin-mediated endocytosis and ALIX-syntenin-1-mediated exocytosis protect the cell membrane from damage caused by necroptosis. Science Signaling  28 May 2019: Vol. 12, Issue 583, eaaw3423 DOI:10.1126/scisignal.aaw3423

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