責(zé)編 | 兮

阿爾茲海默癥（Alzheimer's Disease,AD）是最常見(jiàn)的一種以患者的記憶力減退,，認(rèn)知能力障礙,，情緒調(diào)節(jié)異常等為特征的神經(jīng)退行性疾病。伴隨人口壽命的增長(zhǎng),，這類(lèi)嚴(yán)重威脅中老年生命質(zhì)量的疾病發(fā)病率也與日俱增，然而截至目前,，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的各種解釋呈百家爭(zhēng)鳴的局勢(shì),。其中最為普遍被人們接受的是淀粉樣蛋白假說(shuō)（The amyloid hypothesis），淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein,APP）作為這一假說(shuō)的核心,，其被β-與γ-分泌酶切割生成的β-淀粉樣蛋白（amyloid-β,，Aβ）長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是導(dǎo)致AD相關(guān)病理?yè)p傷的始作俑者。因此,，從根本上解決Aβ的產(chǎn)生機(jī)制問(wèn)題對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)于AD有效的治療手段顯得尤為重要,。

2018年11月29日，美國(guó)桑福德·伯納姆·普雷比醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute）的Jerold chun與Tao Long研究組（下文統(tǒng)一簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)ee等）在Nature上合作發(fā)表題為“Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons”的文章【1】,。該研究成果曾被置于Science官網(wǎng)頭版頭條報(bào)道,，并被評(píng)價(jià)為點(diǎn)燃阿爾茲海默癥的“里程碑式的發(fā)現(xiàn)”。

文章中,，Lee等通過(guò)對(duì)散發(fā)性阿爾茲海默癥（sporadic Alzheimer's Disease,SAD）患者和健康個(gè)體的大腦分選出的神經(jīng)元細(xì)胞核進(jìn)行研究,，提出大腦神經(jīng)元中的APP基因存在不同于野生型基因座的形式，而是以不計(jì)其數(shù)的變異“基因組cDNA”（genomic cDNA,gencDNA）的形式通過(guò)“鑲嵌”模式插入到基因組當(dāng)中,。隨后,，作者們?cè)谥袊?guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系中模擬APP gencDNA生成，通過(guò)H2O2刺激和核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（RTi）處理,，提出gencDNA形成的必要條件：即DNA斷裂和逆轉(zhuǎn)錄酶活性,。接下來(lái)，在AD的J20小鼠模型中借助用于鑒定人APP gencDNA的DNA原位雜交（DNA in situ hybridization,DISH）探針也在2.3年觀察期間內(nèi)檢測(cè)到與年齡相關(guān)的gencDNA增長(zhǎng),。

該研究認(rèn)為,，基于gencDNA內(nèi)含子缺失，外顯子間經(jīng)由外顯子內(nèi)接頭（intra-exon junctions,IEJs）連接,，堿基插入,、缺失或單核苷酸變異（single-nucleotide variants,SNVs）等序列特征，以及對(duì)轉(zhuǎn),、DNA斷裂,、逆轉(zhuǎn)錄酶活性的要求,，gencDNA可能產(chǎn)生于神經(jīng)元內(nèi)RNA發(fā)生的“逆轉(zhuǎn)錄-插入”事件（retroinsertion）誘發(fā)的體細(xì)胞基因重組（somatic gene recombination,SGR）。值得注意的是,，截至當(dāng)時(shí)尚未有任何關(guān)于特定基因可能發(fā)生體細(xì)胞基因重組研究的報(bào)道,。

圖一，工作模式圖

那么,，APP gencDNA是否能被轉(zhuǎn)錄及翻譯成為具有生物活性的產(chǎn)物呢,？研究人員在體外構(gòu)建分別包含三種APP gencDNA變體的質(zhì)粒，在SH-SY5Y細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)并檢測(cè)其細(xì)胞毒性,，結(jié)果顯示三種APP gencDNA變體中的兩個(gè)能明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞的存活率,。由此我們可以得知，并非所有類(lèi)型的gencDNAs都能產(chǎn)生致病性影響,，正如研究中所提到的在健康個(gè)體大腦的神經(jīng)元中也能檢測(cè)到多種gencDNA的存在,，不過(guò)種類(lèi)和豐度相較于SAD個(gè)體而言均有3-5倍的降低。

總體而言,，這項(xiàng)研究提供了特定基因（本文中為APP）可以發(fā)生體細(xì)胞基因重組的新思路,。健康及患病個(gè)體大腦中APP gencDNAs的存在可能與神經(jīng)元正常生理功能及阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)制都具有相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)能否解釋以往針對(duì)Aβ的臨床治療方案失敗的原因,，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證,。

出乎意料的是，2020年8月19日,，來(lái)自波士頓兒童醫(yī)院的Christopher A. Walsh與Eunjung Alice Lee研究組（下文統(tǒng)一簡(jiǎn)寫(xiě)為Kim等）對(duì)該文章的結(jié)論提出質(zhì)疑,，并在Nature上發(fā)表題為“APP gene copy number changes reflect exogenous contamination”的文章【2】，指出Lee等檢測(cè)出的APP gencDNA是外源污染的假象,，并非真正的來(lái)自于內(nèi)源APP的體細(xì)胞基因組整合,。

首先，Kim等研究人員對(duì)Lee等的原始APP靶向測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,，雖檢測(cè)到了APP基因的IEJs,，卻未能檢測(cè)到跨APP和目標(biāo)插入位點(diǎn)的任何讀段；取而代之的是,，在APP編碼序列的兩端檢測(cè)到多個(gè)含pGEM-T Easy Vector多克隆位點(diǎn)的剪接片段,，并且在Lee等所在實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)關(guān)于小鼠腦內(nèi)體細(xì)胞拷貝數(shù)變異的研究中，在小鼠單神經(jīng)元全基因組測(cè)序（single-cell whole-genome sequencing ,scWGS）數(shù)據(jù)集中觀察到同一人源APP pGEM-T Easy Vector以及另一攜帶APP插入序列的質(zhì)粒骨架序列（pTripIEx2）污染的情況,，指出該實(shí)驗(yàn)室存在多種類(lèi)型的重組載體反復(fù)污染的情況,。

隨后，從Lee研究中的SureSelect雜交捕獲測(cè)序數(shù)據(jù)中,，通過(guò)計(jì)算包含載體骨架序列的剪接片段占APP編碼序列兩端的總讀取深度的分?jǐn)?shù)以表示載體污染的水平,，而每個(gè)APP外顯子連接處檢測(cè)的剪接片段的分?jǐn)?shù)，表示APP gencDNA的總量（APP逆轉(zhuǎn)錄拷貝或載體插入片段）,。編碼序列末端包含載體骨架的分?jǐn)?shù)為1.2％,，與外顯子連接處1.3％的分?jǐn)?shù)相當(dāng),，因而Kim等認(rèn)為載體污染是所有外顯子連接處剪接片段的主要來(lái)源。此外,，Kim等認(rèn)為即使囊括這些源自載體的讀段在內(nèi),，所有分?jǐn)?shù)都遠(yuǎn)低于Lee研究中DISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果給出的16.5％gencDNA的保守估計(jì)。

接下來(lái),，他們?cè)贚ee等最新的以6名AD患者和1名對(duì)照個(gè)體大腦生成的全外顯子測(cè)序（whole-exome sequencing,WES）數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)APP巢式PCR（nested PCR）產(chǎn)物,，即WES中支持APP gencDNA的讀段與原始Lee研究中使用的巢式PCR引物的目標(biāo)位點(diǎn)對(duì)齊。不僅如此,，他們?cè)赑ark等人【3】的一項(xiàng)展示AD患者腦樣本的深度WES數(shù)據(jù)集的獨(dú)立研究中,，發(fā)現(xiàn)全基因組人類(lèi)和小鼠mRNA污染的證據(jù)，且主要存在于WES數(shù)據(jù)集中報(bào)告支持APP gencDNA的讀段,。Kim等研究人員認(rèn)為,，即使在采用高質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的情況下，二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)中仍普遍存在外源性污染,，并強(qiáng)調(diào)需要進(jìn)行嚴(yán)格的數(shù)據(jù)分析以減輕這些重要偽像的來(lái)源。

進(jìn)一步的,，Kim等為了驗(yàn)證Lee研究中的IEJs可能是污染的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR偽像（artefact）的猜想,，他們使用攜帶兩種不同APP亞型（APP-751，APP-695）的重組載體,，以及報(bào)道的PCR引物與三種不同的PCR酶重復(fù)了RT-PCR和PCR分析,。結(jié)果顯示，在APP插入片段和PCR酶的所有組合下,，均明顯觀察到與原始APP插入片段相比大小各異的嵌合擴(kuò)增條帶,，進(jìn)一步的通過(guò)測(cè)序確認(rèn)它們的確包含APP插入片段的許多IEJs。而Lee研究中先前鑒定的17個(gè)IEJs中有12個(gè)同樣出現(xiàn)在這次測(cè)序結(jié)果中,，因此認(rèn)為先前鑒定的APP gencDNA均可能是來(lái)自外源污染的PCR偽像,。

最后，為了獨(dú)立研究是否真實(shí)存在潛在的APP gencDNA,，Kim等研究人員在來(lái)自64個(gè)AD和119個(gè)對(duì)照個(gè)體神經(jīng)元scWGS數(shù)據(jù)中檢索體細(xì)胞APP gencDNA,。如果存在逆轉(zhuǎn)錄基因插入，則應(yīng)該能觀察到明顯的序列特征：外顯子讀取深度的增加,，外顯子連接處的讀段剪接,，3'UTR末端的poly-A尾巴，和跨外顯子的不一致讀對(duì),，然而卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何APP gencDNA存在的證據(jù),。

根據(jù)這些結(jié)果，Kim等研究人員認(rèn)為L(zhǎng)ee等報(bào)道的APP gencDNA似乎可以歸因于各種類(lèi)型的外源性污染,，尤其是APP重組載體,，PCR產(chǎn)物和全基因組mRNA污染,。他們希望Lee等有必要提供明確的證據(jù)，例如支持新的APP插入微點(diǎn)的讀段,，排除污染因素等,，以證明在神經(jīng)元中APP基因確實(shí)能夠發(fā)生體細(xì)胞基因重組現(xiàn)象。

在同期Nature上,，針對(duì)他們提出的質(zhì)疑,，Lee等作出如下回應(yīng)【4】。

1）體細(xì)胞基因重組的可預(yù)測(cè)結(jié)果是產(chǎn)生不同于野生型基因座的新型逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn),，先前研究中已經(jīng)DISH證實(shí),；且由激光捕獲的人海馬或血液中DNA的全外顯子組下拉產(chǎn)生的獨(dú)立發(fā)表的數(shù)據(jù)集的分析顯示，在八條不同的染色體中鑒定出十個(gè)不同的APP插入位點(diǎn),。Lee等表示目前還未能察覺(jué)可能產(chǎn)生這些結(jié)果的污染源,，這些結(jié)果與DISH數(shù)據(jù)所顯示的APP gencDNA的位置與野生型APP不同完全一致，且這些新的APP gencDNA插入位點(diǎn)強(qiáng)烈支持APP gencDNA的自然發(fā)生,。

圖二,，鑒定人類(lèi)基因組中新的APP插入位點(diǎn)

圖三，雙探針DISH顯示gencDNA與野生型基因座定位

2）Lee等認(rèn)為Kim等在個(gè)別數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的外源載體污染（pGEM-T Easy APP）并不能確切的解釋所有的APP IEJs,。對(duì)另外三個(gè)包含APP gencDNA讀段的數(shù)據(jù)集進(jìn)行信息分析,，已經(jīng)VecScreen和Vecuum script【5】排除可能的質(zhì)粒污染。

3）針對(duì)Kim等提出在Park等的AD患者腦樣本的深度WES數(shù)據(jù)集中存在全基因組人類(lèi)和小鼠mRNA污染的問(wèn)題,，Lee等表示mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA這一過(guò)程需要逆轉(zhuǎn)錄酶活性,，然而在Park等人使用的Agilent SureSelect靶向序列捕獲技術(shù)中并未涉及逆轉(zhuǎn)錄酶，因而不能以全基因組mRNA污染來(lái)否認(rèn)APP gencDNA的存在,。

4）針對(duì)Kim使用含不同亞型APP的質(zhì)粒進(jìn)行PCR產(chǎn)生包含IEJs的序列,，這種非生物性的方法與Lee等鑒定生物性質(zhì)的IEJs的方式之間主要存在以下幾點(diǎn)差異：a，除了使用相同引物序列外,，實(shí)驗(yàn)條件有所不同：Kim等人使用兩倍濃度的引物和超過(guò)一百萬(wàn)倍濃度的模板,；b，Lee等利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（single molecule real-time sequencing,SMRT-seq）鑒定gencDNAs和IEJs序列時(shí)僅使用30個(gè)PCR循環(huán)即可檢測(cè)到,，而Kim等則運(yùn)行40個(gè)PCR循環(huán),；c，Lee等僅鑒定出了來(lái)自AD個(gè)體的大腦的45個(gè)獨(dú)特IEJs和來(lái)自健康個(gè)體大腦的20個(gè)（有重疊部分,，少于65個(gè)）,，而Kim等鑒定出12426個(gè)（約200倍）。

5）值得注意的是,，Kim等提出的“外源污染”觀點(diǎn)無(wú)法解釋疾病狀態(tài)下APP gencDNA形式和豐度的顯著變化,，且這種變化在比較細(xì)胞類(lèi)型時(shí)也很明顯，即當(dāng)同一SAD個(gè)體的大腦樣本中不同細(xì)胞類(lèi)型由DISH同時(shí)處理時(shí),，信號(hào)在神經(jīng)元中比在非神經(jīng)元細(xì)胞中更為普遍,。至關(guān)重要的是,，SMRT-seq僅在SAD個(gè)體樣本中鑒定出在家族性AD中被認(rèn)為是致病性的單核苷酸變異，然而攜帶這種變異的質(zhì)粒并不存在于該實(shí)驗(yàn)可能涉及的任何一個(gè)環(huán)節(jié),。

6） Lee等認(rèn)為Kim將SureSelect雜交捕獲測(cè)序數(shù)據(jù)與DISH的APP gencDNA拷貝數(shù)估計(jì)放在一起比較完全沒(méi)有意義,，因?yàn)閮煞N方法根本不同。首先是雜交介質(zhì)的不同（前者為液相,，后者為固相）,，其次為靶向序列的差異（前者靶向野生型基因座和gencDNA，后者僅靶向gencDNA）,。

7）Kim等通過(guò)檢索自己的scWGS數(shù)據(jù)得出的APP gencDNA的陰性結(jié)果,，這并不能反駁APP gencDNA的存在。Kim等自認(rèn)“基因組擴(kuò)增不均”,，導(dǎo)致約20％的單細(xì)胞基因組覆蓋深度不足10x,，并且在一個(gè)等位基因（~9％等位基因缺失率）或兩個(gè)等位基因（~2.3％基因座缺失率）處均可能出現(xiàn)擴(kuò)增失敗。該失誤率很可能會(huì)錯(cuò)過(guò)這些小至約0.15 kb的APP gencDNA,。

綜上討論,，Lee等認(rèn)為支持體細(xì)胞基因重組和APP gencDNA的數(shù)據(jù)以及結(jié)論仍是完整的，因此有必要在健康及AD大腦中對(duì)APP gencDNA的產(chǎn)生機(jī)制和病生功能繼續(xù)進(jìn)行研究,。有趣的是,，gencDNA對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶活性的依賴(lài)性，可能與65歲以上且接受長(zhǎng)期聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（cART,，其中包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑）的HIV感染者中極其少見(jiàn)罹患AD的情況相關(guān)【6,7】。如果得到證實(shí),。gencDNA及其產(chǎn)物可能能夠解釋AD發(fā)病機(jī)制,，并有助于推動(dòng)新治療策略的發(fā)展。

https:///10.1038/s41586-018-0718-6

https:///10.1038/s41586-020-2522-3

https:///10.1038/s41586-020-2523-2

制版人：MENG

參考文獻(xiàn)

1, Lee, M. H. et al. Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons.Nature563, 639–645 (2018).

2, APP gene copy number changes reflect exogenous contamination

3, Park, J. S. et al. Brain somatic mutations observed in Alzheimer’s disease associated with aging and dysregulation of tau phosphorylation.Nat. Commun. 10, 3090 (2019). 4, Reply to: APP gene copy number changes reflect exogenous contamination

5, Kim, J. et al. Vecuum: identification and filtration of false somatic variants caused by recombinant vector contamination.Bioinformatics32, 3072–3080 (2016).

6, Turner, R. S. et al. An individual with human immunodefciency virus, dementia, and central nervous system amyloid deposition.Alzheimers Dement.(Amst.) 4,1–5 (2016).

7, Centers for Disease Control and Prevention.HIV Surveillance Report,2016 Vol. 28 http://www./hiv/library/reports/hiv-surveillance.html (2017)