對于分子生物學的研究者來講,，NCBI是科研過程中的一大神器,，我們不僅可以在其中查找基因組、基因,、蛋白,，還可以在其中進行文獻查找、序列比對等操作,，連設計引物的功能NCBI也給我們構建好了,，名字叫做Primer designing tool或者Primer-BLAST,。

并且,，基于NCBI龐大的數(shù)據(jù)庫信息,，可以實現(xiàn)對引物擴增特異性的預測,，甚至直接設計出特異性良好的qPCR引物(預測值)。這也是NCBI相比于其他引物設計工具最大的特點,。因此該工具尤其適合設計特異性的熒光定量或半定量PCR引物。下面,，將詳細介紹這種特異性qPCR引物的設計方法：

1. 找到基因序列頁面

關于序列的查找,，在上一期的微信推送中小編已經(jīng)作了詳細介紹，沒有關注到的同學在主頁面中回復“序列查找”即可獲取相關推送信息,。

2. 跳轉到Primer designing tool

① 在基因頁面中,，點擊Pick Primers，即可以直接跳轉到Primer designing tool的頁面,。

② 如果已經(jīng)有了基因的序列,，可以不通過基因查找頁面，直接進入Primer designing tool,。具體的入口是NCBI——BLAST——Primer-Blast,。

3. 設置引物設計相關參數(shù)

引物設計頁面共分為PCR模板、引物參數(shù),、外顯子/內(nèi)含子選擇和特異性檢測參數(shù)四個模塊,，下面將對這四個模塊中的設置進行詳細講解。

① PCR Template

如果您是通過查找序列轉到Primer designing tool的,，那么在PCR Template欄中則會自動出現(xiàn)您的基因的編號,，比如對于human β-actin來講，其mRNA的頁面點擊Pick Primer之后,，PCR Template欄中會出現(xiàn)其對應編號：NM_001101.3,。如果是直接進入Primer designing tool界面，則需要將目的基因的編號或者序列粘貼進該框中,。在右側的Range欄中,，可以設定正反向引物的結合范圍。

② Primer Parameters

引物參數(shù)欄中,，前兩行是引物的序列欄,，用于對已有的引物進行特異性分析，在設計引物的過程中并不會用到,，因此留空即可,。在PCR product size一行中，可以設定PCR引物的擴增產(chǎn)物長度范圍,，對于qPCR來講,，范圍設為50~250時結果比較精確，可以先設定一個較小的范圍,，如80~150,，如果該范圍內(nèi)沒有設計出比較好的引物，則可以返回擴大產(chǎn)物大小范圍,。# of primers to return是指軟件設計引物的數(shù)量(如果有的話),，默認為10對。引物的Tm值一行中，可以設定引物的最大,、最小和最佳Tm值,，以及正反向引物Tm的最大差值。對于qPCR來講,，默認的即為最佳Tm值60°C,，不需做任何修改。

③ Exon/intron selection

在抽提RNA的過程中,，樣本中的基因組DNA污染會顯著影響最終的結果,，雖然可以使用DNase I進行處理將RNA樣本中的中DNA降解掉，但是很難保證DNA降解完全,。由于真核生物的基因組由內(nèi)含子和外顯子組成,，而成熟的mRNA僅包含外顯子而沒有內(nèi)含子，因此,，在設計qPCR引物時,，經(jīng)常會選用跨外顯子的方法進行設計，從而保證該引物不會對基因組DNA進行擴增,。

在Primer Design Tool中,，我們可以進行跨外顯子設置，該設置有三個不同的選項,，分別代表：對跨外顯子無要求,、一對引物中至少一條一定要跨外顯子以及引物可以不跨外顯子。要注意,，選擇后兩項時，PCR模板欄中必須要填寫NCBI中序列的登錄號,，如mRNA的NM號,，以便于程序識別其中的外顯子拼接位點。如果手動粘貼序列,，則會因為無法定位外顯子而設計失敗,。

Exon junction span一欄的下方可以對引物跨外顯子的其他參數(shù)進行調(diào)整，如跨外顯子引物在前后兩個外顯子的配對堿基數(shù),、內(nèi)含子長度,、擴增產(chǎn)物是否允許在統(tǒng)一外顯子上等。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters

良好的引物特異性能夠保證在qPCR過程中只擴增出目的基因的片段,，而不會出現(xiàn)非特異性結合與擴增產(chǎn)物,，這對保證qPCR結果的真實可靠是至關重要的。除了在qPCR最后一步添加熔解曲線檢測步驟,，我們更應該在設計引物的時候就保證引物的特異性,，哪怕僅僅是在軟件預測的層面上。

Primer Design Tool的最后一部分參數(shù)設置就是針對引物特異性檢測的。首先,，要確保Specificity check一欄中已經(jīng)打勾,。Search mode一般選擇Automatic即可，這樣當用戶輸入的模板在比對的數(shù)據(jù)庫中有很多相似的序列時（比如一段DNA序列在多個轉錄變體中都有）,，用戶可以選擇哪一些是需要檢測的PCR模板,。Database是指特異性檢測所用到的數(shù)據(jù)庫：對于常用的檢測基因表達上下調(diào)變化，一般選擇Refseq mRNA,，因為此時PCR模板是mRNA的逆轉錄產(chǎn)物,；若要檢測lncRNA，該數(shù)據(jù)庫就應該選擇覆蓋面更廣的Refseq RNA,。若模板是基因組,，則應該選擇Refseq representative genomes。在Exclusion行中,，可以對預測的序列以及環(huán)境/不可培養(yǎng)樣本序列的干擾,。Organism是指樣本所屬物種，將物種名稱如：Homo sapiens(或直接human)輸入,，選擇候選欄中對應的物種即可,。也可以直接輸入物種ID (常用的如：人9606，小鼠10090,，大鼠10114),。在Organism下方，可以對特異性要求的嚴格程度進行設置,，比如引物對非特異結合位置至少要有幾個不匹配堿基等,。在Splice variant handling一欄中，我們可以勾選上,，使得引物由“轉錄本特異”變?yōu)椤盎蛱禺悺?，即能與該基因的多個轉錄變體結合。但需要注意的是,，該選項只能保證設計出的引物可以結合多個轉錄變體,，但并不能保證所有的轉錄變體都能檢測到。

如果需要設計能夠覆蓋所有轉錄變體的引物,，可以參考上一期的微信推送中“多轉錄變體的共有序列查找”一文,，將所有轉錄變體的共有序列粘貼到序列框中即可。

⑤ 高級參數(shù)設置

在Advanced parameters中,，我們可以進一步對引物的參數(shù)信息進行調(diào)整,，如特異性檢測參數(shù)、引物長度,、GC含量范圍等等,。其中比較常用到的是最后一項：內(nèi)部雜交寡核苷酸(Internal hybridization oligo),，可以在此進行Taqman探針的設計。

雖然上面羅嗦了這么多,，但實際上大多參數(shù)在Primer designing tool中已經(jīng)預設好了,，無需做任何改動。絕大多數(shù)情況下,，我們只需要調(diào)整PCR產(chǎn)物大小,、引物Tm值、物種等參數(shù)即可,。參數(shù)設置結束之后,，點擊“Get Primers”，即可等待結果的出現(xiàn)了,。

4. 設計結果中優(yōu)秀引物的選取

這里以人的GAPDH為例,，該基因有四個轉錄變體，將轉錄變體的共有序列粘貼到序列框中,，產(chǎn)物大小設置為80-150 bp,，另外為了保證引物質(zhì)量，將Max Poly-X設置為3,，即引物中不能出現(xiàn)超過三個以上連續(xù)相同堿基,。

點擊Get Primers，系統(tǒng)會對這段序列進行Blast,，彈出以下界面讓您選擇對應的轉錄本,，由于我們粘貼了共有序列，因此四個轉錄本都會列出,，這里點擊“All”將這四個都選中,，之后點擊Submit提交。

經(jīng)過一段時間的等待,，我們得到了NCBI設計的引物序列,，如下圖所示有三對引物，每一對引物的特性和序列都羅列其中,。

引物的特性有以下幾個方面：序列,、模板鏈,、長度,、起止位置、Tm,、GC含量,、自我互補能力、產(chǎn)物大小以及引物對應的模板,。其中多數(shù)特性都或多或少影響了引物的好壞,，比如：序列中最好不要出現(xiàn)連續(xù)的相同堿基（尤其在3端）,；正反向引物的Tm值要接近；以Oligo dT引物進行逆轉錄時,，引物的起止位置要盡量靠后,；引物對的自我互補配對打分要盡量低。根據(jù)上述幾個簡單規(guī)則,，很快就能夠在NCBI反饋的結果中挑取到合適的引物了,。

當然，所有這些引物特性都是根據(jù)公式打分得到的,，只是起到了建議的作用,，并不能代表該引物的實際使用情況，特性好的引物在實際使用過程中不一定表現(xiàn)優(yōu)秀,，反之特性不好的引物也不一定不能夠使用,，但是NCBI的引物設計工具憑借基因序列直達引物設計的入口、其豐富的設置選項,、特異性預測的功能還是得到了廣大科研工作者的青睞,，熟悉掌握了該工具，將為您的分子生物學實驗起到很大幫助,！