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   實驗表明，用單引物擴(kuò)增只能擴(kuò)增幾條大約0.5~1kb的片段,；使用較短引物,，10堿基RAPD引物，以及含有SRAP引物核心序列的14－15堿基大小的引物,，這些引物組合可得到多種擴(kuò)增片段,，但是擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定，特異性不強(qiáng),；20-22堿基引物放射自顯影的結(jié)果背景太強(qiáng),；合適的引物大小在17－18堿基。

2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增

   反應(yīng)模板多數(shù)是基因組DNA,，也可以是cDNA,。在一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，0.2mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mgcl2,0.3µmol/L引物,，1U Taq酶,。SRAP-PCR反應(yīng)采用復(fù)性變溫法：開始94℃變性5min；反應(yīng)前5個循環(huán)在94℃ 1min,，35℃ 1 min,，72℃ 1－2 min條件下運行；之后30－35個循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃,，最后延伸5~7 min,。
   前5個循環(huán)復(fù)性溫度設(shè)為35℃ ，主要是考慮到低的復(fù)性溫度能確保兩個引物與靶DNA部分配對,；隨后循環(huán)中復(fù)性溫度升到50℃,，可保證前5個循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物可在余下循環(huán)中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增；如果復(fù)性溫度在40個循環(huán)中都保持在35℃,，擴(kuò)增片段重復(fù)性將很低,。

2.4擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與片段測序

   擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，通常膠板35 cm×43cm,，厚度0.8mm,，每孔加樣 8－20 微升，以保證單條帶足夠量回收,?？墒褂猛凰兀部刹捎勉y染技術(shù),；用2.0%的瓊脂糖凝膠也可分析多態(tài)性,，但分辨的條帶較少。
   對標(biāo)記測序有可能獲得更多的遺傳信息,。由于多數(shù)SRAP產(chǎn)生高強(qiáng)帶,，很少有重疊,，而且引物較長，故比AFLP易測序,。獲得的SRAP標(biāo)記差異片段,，從膠上割下、回收后,，用相應(yīng)引物直接測序,，必要時可采用克隆測序,。

2.5 SRAP標(biāo)記特征

   由于在設(shè)計引物時正反引物分別是針對序列相對保守的編碼區(qū)與變異大的內(nèi)含子,、啟動子和間隔序列，因此,，多數(shù)SRAP標(biāo)記在基因組中分布是均勻的,，通過利用RIL系構(gòu)建的遺傳連鎖圖也說明了這一點。同時發(fā)現(xiàn)在130個SRAP標(biāo)記中,，約20%為共顯性,，這種高頻率的共顯性則明顯優(yōu)于AFLP標(biāo)記。
   利用同一引物組合,，從甘藍(lán)類不同作物中（包括花椰菜,、青花菜等）可獲得多個SRAP標(biāo)記。單個組合在每個個體中可檢測到至少10條多態(tài)性譜帶,，其中一些為作物特異的,；在不同的實驗中多態(tài)性條帶重復(fù)性極好。 SRAP標(biāo)記測序顯示多數(shù)標(biāo)記為外顯子區(qū)域,。25條多態(tài)性帶中16條（64%）序列GC含量超過35%,，表明可能是外顯子部分；Blast搜索表明60%條帶與已知基因序列高度一致,，這就確認(rèn)了SRAP產(chǎn)生的多數(shù)標(biāo)記包含了可譯框中的外顯子,。測序還表明SRAP多態(tài)性產(chǎn)生于兩個方面：由于小的插入與缺失導(dǎo)致片段大小改變，而產(chǎn)生共顯性標(biāo)記,；核苷酸改變影響引物的結(jié)合位點,，導(dǎo)致顯性標(biāo)記產(chǎn)生。

3. TRAP標(biāo)記原理與方法

   靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性 (target region amplified polymorphism,，TRAP)也是一種新型的基于PCR標(biāo)記,，由美國農(nóng)部北方作物科學(xué)實驗室Hu與Vick于2003年提出。與SRAP,、RAPD和AFLP等標(biāo)記技術(shù)無須任何序列信息即可直接PCR擴(kuò)增不同,，TRAP技術(shù)是基于已知的cDNA 或EST序列信息。目前已獲得許多物種基因組序列的豐富信息,，包括人類,、擬南芥,，以及重要作物水稻和多種微生物的基因組序列草圖繪制成功，有大量的EST序列可供使用,，從而使得可以利用生物信息學(xué)工具和EST數(shù)據(jù)庫信息產(chǎn)生出許多靶基因序列的TRAP多態(tài)性標(biāo)記,，而且極易將性狀與標(biāo)記相關(guān)聯(lián)。
   TRAP技術(shù)是從SRAP技術(shù)改進(jìn)而來的,。SRAP使用兩個任意引物,；而TRAP是使用長度為16~20核苷的固定引物（fixed primer）與任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用數(shù)據(jù)庫中的靶EST序列設(shè)計而來,；任意引物與SRAP所用的一樣,，為一段以富含AT或GC為核心、可與內(nèi)含子或外顯子區(qū)配對的隨機(jī)序列,。固定引物的設(shè)計步驟為：從EST數(shù)據(jù)庫中鑒別所需序列,，再采用有關(guān)引物設(shè)計軟件（如Primer3等） 設(shè)定核苷酸序列合理長度（18堿基）與最適、最大和最小Tm值（53,、55,、50℃），最后選定最適的引物; 任意引物設(shè)計完全同SRAP技術(shù),。TRAP-PCR反應(yīng)條件與SRAP-PCR完全一致,。每次TRAP-PCR反應(yīng)在6.5%聚丙烯酰胺測序膠可產(chǎn)生50－900bp的片段30-50 個。

4 應(yīng) 用

   SRAP分子標(biāo)記系統(tǒng)最早是在蕓薹屬作物開發(fā)出來,。目前已在其他作物如馬鈴薯,、水稻、生菜,、油菜,、大蒜、蘋果,、櫻桃,、柑橘與芹菜中也成功擴(kuò)增。TRAP技術(shù)是在向日葵中開發(fā)的,，目前已成功應(yīng)用于其他作物如水稻,、菜豆、大麥,、小麥,、甜菜。主要用于種質(zhì)資源的鑒定評價,、遺傳圖譜的構(gòu)建,、重要性狀基因標(biāo)記、gDNA與cDNA指紋分析乃至圖位克隆等方面,。

4.1種質(zhì)資源的鑒定評價

   由于在不同物種,、不同個體間具有一定的多態(tài)性,，SRAP技術(shù)也成功應(yīng)用于種質(zhì)鑒定與評價工作中。Ferriol等（2003）對甜瓜（Cucurbita pepo）的2個變種69份類型代表性材料遺傳多樣性進(jìn)行了SRAP,、AFLP標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分析,，結(jié)果表明，與形態(tài)學(xué)變異及類型的進(jìn)化歷史一致性方面,，SRAP標(biāo)記提供的信息比AFLP標(biāo)記更優(yōu)良,；11個SRAP引物組合獲得88條可重復(fù)的條帶，平均8條,，其中64條（72.7%）為多態(tài),，大小在154-653bp 之間；測序發(fā)現(xiàn)多個標(biāo)記序列與已知cDNA或EST高度同源,。另外還利用SRAP標(biāo)記對筍瓜（C.maxima）19 份種質(zhì)及8份南瓜屬材料遺傳多樣性進(jìn)行分析,，24個引物組合產(chǎn)生的114個標(biāo)記中多態(tài)性占33%,，雖然低于RAPD比例,，但聚類分析與主坐標(biāo)分析表明，SRAP標(biāo)記分析可將材料按照使用類型（食用,、飼用,、觀賞用）來分組。因此,，在對育種目標(biāo)性狀的評價方面,，明顯優(yōu)于RAPD標(biāo)記。
   野牛草（Buffalograss）生長緩慢,、耐旱,、耐瘠、抗蟲,，倍性多樣,，遺傳基礎(chǔ)廣泛。Budak等利用SRAP標(biāo)記分析了buffalograss的43個基因型遺傳多樣性,，結(jié)果也表明SRAP是一個評價遺傳多樣性,、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具。
   向日葵屬野生種在栽培品種遺傳改良方面很有價值,，對于重要病害,，尤其是霜霉病是很好的抗源，但大部分野生種是多年生,，從野生種中鑒定基因非常困難,。Hu等設(shè)計了與向日葵EST數(shù)據(jù)庫中編碼富含亮氨酸重復(fù)（LRR）類似蛋白序列配對的固定引物，利用TRAP標(biāo)記分析,，對向日葵屬16個野生種及其2個雜交種的遺傳變異性進(jìn)行評估,。結(jié)果表明TRAP標(biāo)記可用于評估向日葵的遺傳多樣性,，材料的聚類結(jié)果與經(jīng)典分類相一致；其中一個TRAP引物結(jié)合到與抗病性有關(guān)的基因序列,。表明TRAP技術(shù)將在種質(zhì)基因型鑒別和重要目的農(nóng)藝性狀的基因標(biāo)記方面存在廣泛的應(yīng)用前景,。

4.2 遺傳圖譜構(gòu)建

   利用collard × cauliflower形成的RIL86個群體，構(gòu)建了由130個SRAP,、120個AFLP標(biāo)記組成的遺傳圖譜,。類似AFLP標(biāo)記，SRAP均勻分布平衡在9個重要連鎖群上,。高頻率共顯性與在基因組中均勻分布的特性將使其優(yōu)于AFLP標(biāo)記而成為一個構(gòu)建遺傳圖譜的良好標(biāo)記體系,。

4.3 繪制基因組轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptome map）

   轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptome map）是進(jìn)行比較基因組學(xué)研究極為有效手段。利用基于PCR的cDNA-SRAP分析來檢測編碼區(qū)的多態(tài)性將簡便,、高效,、快捷。利用花椰菜DH植株與青花菜雜交產(chǎn)生的F2群體88個單株,，使用48引物組合,，從88個cDNA中檢測到281個多態(tài)性cDNA -SRAP標(biāo)記，平均每個引物對產(chǎn)生6個,，21.1%為共顯性,；構(gòu)建了由247個標(biāo)記組成的轉(zhuǎn)錄圖譜。利用這個圖譜,，成功進(jìn)行了甘藍(lán)類蔬菜作物與擬南芥基因組的基因排列與組成分析,，發(fā)現(xiàn)這兩類基因組的廣泛同一性，在190個多態(tài)性cDNA-SRAP標(biāo)記中,，共有169個相似序列,；這種同一性集中在某些染色體片段而非整個染色體上；甘藍(lán)中大多數(shù)重復(fù)區(qū)段集中對應(yīng)于擬南芥1號與5號染色體,，而不是2號與4號染色體,。

4.4 重要性狀基因標(biāo)記

   重要農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖標(biāo)記的獲得，將可進(jìn)行性狀分子標(biāo)記輔助選擇,，提高育種的選擇效率與預(yù)見性,，加快新品種的選育進(jìn)程。常用的標(biāo)記作圖群體有F2,、BC1,、DH、RIL等,，標(biāo)記策略有BSA,、NIL以及GRA等。BoGLS-ALK基因是十字花科中調(diào)節(jié)脂肪族芥子油糖苷脫飽和基因,。利用RIL群體,，采用SRAP技術(shù),，將該基因定位到連鎖群L1，距顯性標(biāo)記SRAP133 1.4cM,。
   Li等于2003年在大白菜中也發(fā)現(xiàn)了一個與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標(biāo)記,，在油菜中篩選到一個與Rf連鎖的SRAP標(biāo)記，在芹菜中獲得一個與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記,。

4.5 SRAP標(biāo)記測序與基因克隆

   多數(shù)SRAP標(biāo)記包含了可譯框中的外顯子,，這為特定性狀基因的分離克隆提供了極大方便。進(jìn)一步測序與Blast分析發(fā)現(xiàn),，通過RIL群體獲得BoGLS-ALK基因的顯性標(biāo)記SRAP133 與擬南芥中BAC克隆F4C21中一未知基因的可譯框高度同源,，該基因位于5號染色體上，此基因座已經(jīng)定位了一個去飽和基因,。據(jù)此推測標(biāo)記SRAP133也在這個基因內(nèi)部,。
   綜合運用擬南芥相關(guān)基因序列信息，應(yīng)用SRAP技術(shù)對青花菜BAC克隆測序,，最終克隆了芥子油糖苷合成途徑中一關(guān)鍵基因BoGLS-ELONG,。
   Li等利用SRAP技術(shù)獲得一個與BoGLS-ALK基因共分離的標(biāo)記，再用此標(biāo)記序列來篩選青花菜BAC文庫的一個BAC克隆,，成功分離到BoGLS-ALK基因,；并通過遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入擬南芥,，進(jìn)行了該基因的功能分析,。同時正在從結(jié)球白菜的花粉母細(xì)胞、減數(shù)分裂期的花蕾分離出mRNA,，進(jìn)行cDNA的SRAP指紋圖譜分析,，以期克隆一些特異表達(dá)的基因，并初步獲得PMC特異表達(dá)的基因,。